新型miRNA芯片技术平台的建立与评价

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1、中国科学院研究生院理学博士论文新型miRNA芯片技术平台的建立与评价导师：李炯研究员阎锡蕴研究员专业：细胞生物学EstablishmentandevaluationofanewmiRNAmicroarrayplatformByDeminDuanSupervisor:ProfessorJiongLi&ProfessorXiyunYanSpeciality:CellBiologyBeingaDissertationsubmittedinpartialfulfillmentoftherequirementfortheawardofthed

2、egreeofDoctorofPhilosophyinBiologyIntheSuzhouInstituteofNano-Tech&Nano-Bionics,ChineseAcademyofSciencesAugust,2010独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国科学院研究生院或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，

3、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。签名：_________日期：_________关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国科学院研究生院有关保管、使用学位论文的规定，其中包括：①学校有权保管、并向有关部门送交学位论文的原件与复印件；②学校可以采用影印、缩印或其它复制手段复制并保存学位论文；③学校可允许学位论文被查阅或借阅；④学校可以学术交流为目的，复制赠送和交换学位论文；⑤学校可以公布学位论文的全部或部分内容。（涉密的学位论文在解密后应遵守此规定）签名：_______________导师签名：__

4、_____________日期：______________摘要摘要microRNAs(miRNAs)是生物体内源的一类非编码的小分子RNA。自从1993年在线虫中发现第一个miRNAlin-4以来，miRNAs已经成为分子生物学中最受关注的研究领域。miRNAs通过部分互补序列与靶mRNAs结合，从而在转录后水平对基因表达进行调控。细胞的发育、分化、增殖、凋亡，每个过程都与miRNAs的调控有关；在许多人类肿瘤病例中，均发现有miRNAs表达异常，它与癌症的发育息息相关，是一个有潜质的生物标志物。miRNAs研究中关键的一个环节是

5、miRNAs表达谱的分析。对于这种高通量的表达谱分析，微阵列芯片当然是首选。用微阵列芯片分析miRNAs表达谱，通常都需要在杂交前对样品进行分离、标记、纯化，这是整个检测过程中最耗时耗力、费用昂贵的一个步骤，并且在这个过程中由于酶的使用及步骤的增加还可能改变样品中目标序列的初始比例，影响实验结果的可靠性。本论文的主要目的是建立一种新型miRNA芯片技术平台，从而免除对样品的标记过程，使标记和杂交同时进行。由于这种新型芯片技术平台是基于堆积杂交（StackingHybridization）的原理，而且引入了一段事先标记好的8碱基长的通

6、用标签（UniversalTag，UT），因而我们把它命名为SHUT检测方法。实验结果表明该新型芯片技术平台具有较高的灵敏度，检测限可以达到20fM水平；另外发现其具有很好的选择性，可以区分只有1个碱基错配的miRNAs家族成员；尤其是该技术平台可以有效地排除非活性的pri-miRNA与pre-miRNA前体的交叉杂交信号，这使得我们能够直接将100ng的细胞总RNA用于检测分析。利用这一新型miRNA芯片技术平台分析了几种细胞系的miRNAs表达谱，并用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行验证，发现芯片结果与qRT-PCR

7、结果具有高度的一致性。这些实验结果说明该新型miRNA芯片技术平台对于miRNAs及其他短链核酸分子的检测分析，是一个理想的快速的检测平台。关键词：堆积杂交，通用标签，miRNA芯片，表达谱IAbstractAbstractPh.D.Candidate:DeminDuan(CellBiology)Directedby:Prof.JiongLiMicroRNAs(miRNAs)areaclassofshort,endogenous,non-codingsmallRNAs.SincethefirstmiRNAlin-4wasdiscov

8、eredinCaenorhabditiselegans(C.elegans)in1993,miRNAshavebecomethemostattractedmembersinmoleculararea.Theyregulategenee