《克隆抗体的制备》PPT课件

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1、抗体制备多克隆抗制备单克隆抗制备动物产生抗体的机理抗原（非自己的物质）免疫动物激活免疫B细胞转化成浆细胞分泌特异性的抗体单克隆抗体制备原理-----单克隆抗体杂交瘤技术基本流程单克隆抗体的制备步骤1.免疫原的制备：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000Da物质半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体2.免疫动物选择体重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制备抗原免疫。50—100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.

2、5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。一只兔子每次的免疫剂量：细胞抗原不低于1x107；可溶性抗原100ug－1mg；合成抗原为2mg（半抗原约为20－200ug），选用皮内、皮下、肌肉、静脉、或淋巴结内途径进行免疫，一般抗原免疫3－4次，合成抗原免疫6次以上，两次免疫间隔时间3周3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用

3、50%PEG（Sigma）作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养器皿中培养。4.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。5.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成1

4、－10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％BSA或3－6％牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37℃1－2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃1－2小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/LH2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有

5、限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。阳性孔的检测杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞通常用含有8％--10%的二甲亚砜和20％小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。6.单克隆抗体腹水制备及纯化取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3mi

6、n，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06MPH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。ELISA方法用常规间接ELISA方

7、法检测单抗腹水效价，腹水效价在10－5―10－7之间的可用于实际应用。单克隆抗体和多克隆抗体的比较比较项目多克隆抗体（PcAb）单克隆抗体（MAb）免疫原要求免疫原纯度高，抗体纯度才能高不纯的免疫原可以获得高纯度抗体抗体产生细胞多克隆性单克隆性均质性高度异质高度纯质特异性较高，与抗原上多种决定簇结合高，与抗原上特定决定簇结合稳定性较好相对较差，对理化条件敏感标准化较难，不同批次的抗体质量差异大易于标准化，批次间差异小交叉反应很常见，难避免非特异性反应不常见，可避免非特异反应沉淀反应有多数没有实用的血清学