基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术

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1、第２２卷第８期强激光与粒子束Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．８２０１０年８月ＨＩＧＨＰＯＷＥＲＬＡＳＥＲＡＮＤＰＡＲＴＩＣＬＥＢＥＡＭＳＡｕｇ．，２０１０文章编号：１００１４３２２（２０１０）０８１７３１０４基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术盛翠霞，李田泽（山东理工大学电气与电子工程学院，山东淄博２５５０４９）摘要：采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命，时间相关单光子计数采用多波长通道同时记录荧光光子数，可以提高计数效率和信息量，还可以在稳态图像中分离不同荧光团，形成４维图像。并采用多光子激发技术，利用长波长光源发出的两个或多个光子可以

2、激发出一个短波长的光子。多个光子必须几乎同时到达激发点，才能提供被激发分子足够的能量以产生荧光。多光子激发波长较长，生物组织对其散射减小，因而可以穿透到更深层的组织，从而提高荧光成像深度和空间分辨力，并减少对活体样品的损伤。关键词：荧光寿命；时间相关单光子计数；多光子激发；多波长成像中图分类号：Ｑ６３１文献标志码：Ａ犱狅犻：１０．３７８８／ＨＰＬＰＢ２０１０２２０８．１７３１荧光寿命成像技术是利用合适波长的入射脉冲光对生物样品进行激发，通过测量生物组织中的自发荧光发光强度衰减过程时间的不同，来获得荧光团分子内部的能级结构，同时可用来区分样品中的不同分

3、子种［１２］类。由于自发荧光发光强度衰减函数定量图能对荧光分子团及其周围的环境产生很高的区分度，故荧光成像技术在生物组织的功能性成像中特别有效。Ｘ射线是现在最常用的分析检测癌症和其它疾病的工具，但是Ｘ射线的危险性和局限性是众所周知的，现在还没有一种安全技术能够代替它进行软组织成像。荧光寿命成像由于其完全非侵入性、无损性、非电离化辐射，以及能够显示组织中各种化学组分，因而能提供有用的功能信［３］息。荧光寿命成像技术是通过样品微环境内荧光寿命的测量以反映微结构与微环境的不同，因此需将荧光［４］寿命测量和显微测量结合起来，具有高的时空分辨力，能进行生物活

4、体测量。因此该技术在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域具有较好的应用前景。国际上从２０世纪８０年代末才开始荧光寿命成像显微技术方面的研究工作，但发展较快，并已取得一些研究成果。最早从事荧光寿命成像显微技术方面研究的是日本的大阪大学。美国马里兰大学对细胞中的诸如Ｃａ２＋的浓度和ＰＨ值等参数的荧光寿命进行了深入的研究，德国［５］ＭａｘＰｌａｎｃｋ研究所主要进行了荧光寿命成像显微技术的理论、方法及实验研究工作。目前荧光寿命成像技术采用的是单光子激发产生荧光，即采用激光共聚焦扫描显微镜。而且时间相关单光子计数（ＴＣＳＰＣ）的计数［６］效率不是很高。针对存

5、在的这些问题，本文提出新的研究方法：将多光子激发技术和时间相关单光子计数相结合应用于荧光寿命成像。１荧光寿命成像理论分析荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能量，激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式表达为单指数函数狋犐（狋）＝犐０ｅｘｐ（－）（１）τ式中：犐（狋）是样品受到光脉冲激发后狋时刻测量得到的强度；犐是狋＝０时的强度；τ为平均荧光寿命，是分子的０［７］特征值，定义为荧光强度衰减到初始值犐的１／ｅ时所需要的时间。实际上，荧光的发射是一个统计过程，很０少有荧光分子

6、刚好在τ（荧光寿命）时刻发射荧光，荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值１／ｅ所需的时间。荧光寿命的测量是荧光寿命成像的关键。因此荧光寿命成像质量取决于荧光寿命所采用的测量方法。荧光寿命测量方法包括时域法和频域法，本文采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命。１．１光子、光电子统计理论在被测的微弱随机光场作用下，光检测计光阴极发射光电子，其行为可用双随机泊松点过程来描述，光电［８］子时间统计特性可用多重概率密度求平均来得到收稿日期：２００９１１１８；修订日期：２０１００１２７作者简介：盛翠霞（１９７５—），女，讲师，博士研究生，主要从

7、事荧光光谱及荧光寿命成像方面的研究；ｃｕｉｘｉａｓｈｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ。１７３２强激光与粒子束第２２卷狇狋狇犘ｆ（狋１０…狋狇０）＝〈ｅｘｐ［－λ（θ）ｄθ］∏λ（狋犼）〉（２）∫狋０犼＝１式中：狋犼＝狋０＋狋犼０。依据经典、半经典或量子理论都可以得到光检测方程λ（狋）＝α犐（狋）（３）式中：α是比例系数。式（２），（３）说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。１．２时间相关单光子计数荧光寿命成像技术理论依据基于上述光子、光电子理论，可以采用高重复频率的短脉冲激光经过多光子激光扫描显微镜激发样品，样品发射荧光，用探测器探测每次激发所获得的第１

8、个荧光光子到达时间，作为计时终止时间。探测激光光场到达时间，作为计时起始时间。两光电子脉冲经过各自的ＧＨｚ前