蛋白致敏性细胞学评价技术规范征求意见稿.docx

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1、发布GB/TXXXXX—201X中华人民共和国国家标准ICS07.080A21蛋白质致敏性细胞学评价技术规范Technicalspecificationsofproteinallergenicityinvitrobasedoncellularassay（征求意见稿）发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会201X-XX-XX发布201X-XX-XX实施1GB/T××××—201×前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人：GB/T××××—201×GB/T××××—

2、201×蛋白质致敏性细胞学评价技术规范1范围本标准规定了以嗜碱性粒细胞活化试验对蛋白质致敏性评价的方法，包括仪器和设备，试剂和材料，分析步骤及结果计算。本标准适用于蛋白质的细胞致敏性测定，包括β-氨基己糖苷酶释放率、半最大效应浓度。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1β-氨基己糖苷酶释放率β-hexosaminidasereleaserate蛋白质与处于活化状态的RBL-2H3细胞结合后，

3、会使其产生脱颗粒效应从而导致β－氨基己糖苷酶的释放，上清液中β－氨基己糖苷酶含量与细胞内总的β－氨基己糖苷酶含量的比值表示β-氨基己糖苷酶释放率。3.2半最大效应浓度concentrationfor50%ofmaximaleffect,EC50指β-氨基己糖苷酶最大释放率的一半时对应的蛋白质浓度。4原理嗜碱性粒细胞RBL-2H3细胞表面含有大量高亲和力IgE受体，当处于被IgE活化状态时，RBL-2H3细胞与蛋白质结合后，会引起细胞膜稳定性下降，产生脱颗粒效应，从而在胞外释放出β－氨基己糖苷酶等生物活性物质，通过测定β－氨基己糖苷酶释放率和半最大效应浓度可以评价蛋白质致

4、敏程度。5仪器和设备GB/T××××—201×5.1离心机：相对离心力≥1000×g5.2微量移液器：规格2.5μL，20μL，200μL，1mL5.3恒温水浴锅：精度0.1℃5.4二氧化碳细胞培养箱：精度0.1℃5.5电子分析天平：精度0.1mg5.6酶标仪:检测波长405nm6试剂和材料使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的二级水，除非另有说明。6.1小鼠IgE抗体6.210mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2（，）称取80gNaCl，2gKCl，2gKH2PO4，36.2gNa2HPO4·12H2O，溶于超纯水，全部溶解后，定容至1000mL，充分混匀后，调p

5、H至7.2，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或购买同类商品化产品。6.3嗜碱性粒细胞系：RBL-2H3(ATCCCRL-2256)6.4MEM细胞培养基取5%终体积的水加入到1L烧杯中，将MEM干粉培养基倒入烧杯，水洗包装袋内面两次，倒入烧杯中，磁力搅拌助溶，随后加入2.2gNaHCO3，2.383gHEPES。加水定容至1000mL，用HCl或者NaOH调节pH至7.2，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或购买同类商品化产品。临用前加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素。6.5PNAG溶液称取3.68gNa2HPO4·12H2O，0.933g

6、柠檬酸，溶解后加入34.2g4-nitrophenylNacetyl-p-D-glucosaminide（PNAG），加超纯水定容至100mL，即为1mmol/LPNAG溶液。6.6Na2CO3终止液GB/T××××—201×称取5gNa2CO3，加水定容至118mL，避光保存。6.7台氏液（Tyrode’s）准确称取8.0gNaCl,0.2gKCl,0.26gMgSO4.7H2O,0.065gNaH2PO4.2H2O,1.0gNaHCO3,0.2gCaCl2和1.0g葡萄糖，加水定容至1000mL，充分混匀后，调pH至7.2，0.2μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或

7、购买同类商品化产品。7分析步骤7.1细胞培养将RBL-2H3细胞，置于75cm2培养瓶中，加入10mL含10%FBS的MEM培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养48h。7.2细胞接种在倒置显微镜下观察培养瓶中细胞生长情况，当细胞长满（达80-90%）时，弃去培养液，向瓶内加入2.0mL胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，弃去胰蛋白酶液，向瓶内加入10mL含10%FBS的MEM培养液，用血球计数板计数，使得细胞以1×105/mL（200μL/孔）接种到96孔细胞培养板上，37℃，5%CO2培养箱