羊口疮病毒安徽株的分离鉴定及其b2l基因的原核表达

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1、摘要羊口疮病毒又叫羊传染性脓疱病病毒(ORFV)，该病毒属于痘病毒科副痘病毒属病毒。羊口疮病毒具有较强的传染性，主要感染绵羊和山羊等反刍动物。近年来，逐渐有报道该病毒也可感染鹿、松鼠等野生动物。世界各国和地区都有该病的报道，对养羊业造成较大危害和经济损失。除了疫苗接种外，该病尚未找到有效的治疗手段，使用较多的疫苗是弱毒苗和灭活苗，二者在一定程度上能够预防羊口疮病，但存在病毒毒力返强、病毒变异等问题，效果并不理想，因此有必要找到更加有效的措施防范该病毒的传播及危害。从中国安徽省亳州市某羊场采集疑似羊口疮病口腔结痂病料，利用Hela细胞进行病毒分离培养，根

2、据NCBI上已公布的ORFVB2L基因序列，设计一对特异性引物，对特异性B2L基因进行PCR扩增并送至生物公司测序，与已发表的其他毒株进行序列比对，并构建遗传进化树，确定基因进化关系。将该基因克隆至原核表达载体pET-32a中，构建原核表达载体pET-32a-B2L，转化至大肠埃希菌BL21中，经IPTG诱导后，用SDS-PAGE及Westernblot检测目的蛋白及反应原性，蛋白纯化后，注射小鼠，制备多克隆抗体保存备用。结果显示，将该病毒接种到Hela细胞后，3～4天产生细胞病变，细胞表现为脱落、圆缩等特征；PCR显示，在1137bp处有一明显的特异

3、性条带，与目的片段长度一致，与参考序列比对，同源性达到99%，系统发育进化树表明该分离株与辽宁分离株HQ694773的亲缘关系最近，说明成功分离到一株羊口疮病毒，将其命名为ORFV-AH分离株。本试验成功表达了B2L重组蛋白，该蛋白以包涵体形式存在，SDS-PAGE分析表明蛋白约为55kDa，最佳诱导条件为温度37℃、时间4h，IPTG终浓度为1mmol/L，Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫活性。本试验提供了一种羊口疮病毒的检验方法，为安徽省羊口疮病毒的防控提供了技术支撑。关键词：羊口疮病毒；分离鉴定；B2L；原核表达IAbstra

4、ctOrfvirusisalsocalledcontagiousecthyma，whichisanhighlyaddictedepithelialandhighlycontagiousdiseaseofsheepandgoat.OrfvirusisincludedinthePara-poxvirusgenusofthePoxvindaefamily.Orfvirusdistributedallovertheworld,whichcapturedpeople'attentionrecentyears.Attenuatedvaccineandinactiv

5、atedvaccineisusedmostwidelytopreventfromthisdisease.ButvirμLencereturnandtheemergenceofvirusvariantsinsecuritywereoftenhappened.Soitisnecessarytofindsomemeasurestopreventedthisdisease.OrfviruswasisolatedfromthesuspiciousscabmaterialsoflambswhichwascollectedfromAnhui.Helacellwasu

6、sedtoisolateOrfvirus.OnthebasisofthepublishednucleotidesequenceofORFVB2Lgene.TheB2Lgene'sspecificpairofprimersweredesigned.TheB2LgenewasamplifiedbyPCR,thenthephylogenetictreeisconstructed.TheB2Lgenewasabout1137bplong,itshared99%similaritieswiththereferencesequencewhichissubmitte

7、dtoNCBIGenBank,andithadhighhomologywiththeLiaoningstrain(HQ694773).ThentheB2LgenewasclonedintopET-32avector,pET-32a-B2Lrecombinantprokaryoticexpressionvectorwasconstructed,andwassuccessfμLlyexpressedinE.coli.BL21,TheproductwasdetectedbySDS-PAGEandWesternblot.PurifiedrecombinantB

8、2LproteinwasusedasanantigenforBALB/Cmicetomakep