牛源金黄色葡萄球菌分离鉴定及clfa基因真核载体的构建

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文牛源金黄色葡萄球菌分离鉴定及ClfA基因真核载体的构建ConstructionofEukaryoticExpressionVectorofClfAgenefromBovineStaphylococcusaureus王华指导教师姓名赵兴绪（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称临床兽医学研究方向兽医产科学论文答辩日期2015.5.29学位授予日2015.6.19答辩委员会主席刘在新研究员评阅人郑亚东副研究员张小丽副教授2015年6月Gan

2、suAgriculturalUniversityADissertationfortheMasterofVeterinaryConstructionofEukaryoticExpressionVectorofClfAgenefromBovineStaphylococcusaureusPostgraduate:WangHuaAdvisor:ZhaoXingxuSpeciality:VeterinaryobstetricaResearchField:VeterinarySubmittedTime:May

3、29,2015Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要奶牛乳腺炎是阻碍奶牛养殖业发展的主要原因之一，而金黄色葡萄球菌是主要的致病菌之一，且对于不同的地区，患病奶样所分离到金黄色葡萄球菌差异较大。为查明甘肃及周边地县由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的情况，并研制相关的基因工程疫苗，分别从甘肃秦王川、青海民和、宁夏吴忠采集380份奶样。通过金黄色葡萄球菌耐高盐这一特点对这批奶样进行初步筛选，得到41株疑似金黄色葡萄球菌；再通过过氧化氢酶发酵、甘露醇

4、发酵、三糖和Baird–Parker平板等传统方法对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定，获得37株疑似菌株；结合分子生物学方法鉴定ClfA基因，最后确定有35株为金黄色葡萄球菌的病原菌株。选取MD20菌株提取的DNA为模板，扩增ClfA基因扩增产物连接TransT1感受态细胞精确测序，结果显示，扩增长度为1168bp，与已报道的ClfA因子的基因序列(GeneBank:HQ_424292)同源性为98％。用HindⅢ、XhoⅠ两种酶对pGEMT-ClfA和pcDNA3.1-HisB双酶切，并回收目的片段。

5、后将纯化后的目的片段用T4DNA连接酶于水浴锅中16℃连接过夜后，转化至感受态T1细胞，测序结果和菌液PCR鉴定显示，本实验已成功构建了真核表达载体pcDNA3.1B-ClfA。将载体pcDNA3.1B-ClfA稳定转染至人的乳腺癌细胞，传代筛选至细胞稳定，经过trizol法提取RNA，反转录进行检测，收集保存转染成功细胞。Western-blot检测外源蛋白的表达，分子量约为39KDa。本研究为后续的免疫动物实验做了基础工作，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防控具有指导意义，同时也为动物之间病源互

6、相传播的研究提供研究依据。关键词：奶牛乳腺炎；金黄色葡萄球菌；ClfA；真核表达载体构建I甘肃农业大学2015届硕士学位论文SummaryThecowmastitisisoneofthemostimportantdiseasesintheglobaldairyfarms.StaphylococcusaureusisoneofthemajorpathogenicbacteriaanddifferencesinmilksampleseparationtoStaphylococcusaureuswere

7、reportedatdifferentareas.InordertoinvestigatethesituationaroundGanSuprovinceandtodevelopthegeneticengineeringvaccine,wecollected380milksamplesfromLanzhou,WuzhongandMinhe.BecauseofStaphylococcusaureuscangrowinthemediumwithhighsalinity,wehascarriedonthe

8、preliminaryscreeningandfound41suspectedstrains.Throughoxidationofhydrogen,mannitol,threesugarfermentationandenzymefermentationBaird-Parkertablettraditionallaboratoryoperationscanachieve37suspectedstrains.AsClfAgeneisS.aureusbacteriaadhesionfac