重症肌无力差异lncrnas的表达及生物信息学研究

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万方数据中图分类号吕Z垒iUDC舌[坌博士学位论文学校代码10533重症肌无力差异LncRNAs的表达及生物信息学研究Thedifferentially·-expressedLncRNAsandthebioinformaticsanalysis‘，；theniabioinatlcsanaSISInmyasmemagravl。s作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导教师：论文答辩日期李业临床医学神经病学湘雅医院肖波教授杨欢教授丝!圭：!!：三17答辩委员会主席中南大学二零一三年十一月一令一二，平下一月 煳!{ff嬲万方数据学位论文原创性声明～～本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名压日期：塑f主年且月型日、学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：芷y日期：盟年旦月覃日 万方数据博士学位论文中文摘要重症肌无力差异LncRNAs的表达及生物信息学研究摘要目的：通过lncRNA芯片分析重症肌无力并发胸腺瘤患者组和重症肌无力胸腺无异常组及健康对照组的差异lncRNAs和mRNA表达；运用生物信息学方法，预测并分析差异lncRNA的共表达靶基因、lncRNA的生物学功能聚类以及参与的信号通路，通过cis和trans预测分析差异lncRNA参与基因调控中作用机制，构建TF．1ncRNA．靶基因三者的网络关系；采用real．timePCR技术，验证代表性具有差异表达的hacRNAs；为探讨lncRNAs在重症肌无力患者发病机制中的作用奠定基础。方法：1．收集重症肌无力患者及健康正常对照组患者外周血标本，分离外周血淋巴细胞并提取总RNA。2．通过lncRNA芯片，检测和分析重症肌无力患者外周血的lncRNA与mRNA表达谱，以差异倍数大于或等于2，且P小于等于O．05为标准，筛选出重症肌无力并发胸腺瘤患者组与健康对照组比较存在的差异表达lncRNA和mRNA分子。3．通过生物信息学分析，预测靶基因、分析基因聚类、预测富集生物学通路以及构建TF．IncRNA．靶基因网络关系：利用pearson相关系数预测差异表达的lncRNA的靶基因；针对差异性表达的lncRNA的靶基因，应用ENCODE数据库预测可能富集的生物学信号通路，进行基因聚类(GO与pathway)分析，关联分析构建lncRNA．mRNA共表达网络；采用Cytoscape构建TF．1ncRNA．靶基因三元网络关系4．实时荧光PCR验证具有代表性差异表达lncRNAs：选取lncRNA芯片检测具有代表性显著差异表达的lncRNAs，采用real．timePCR技术，验证其在重症肌无力并发胸腺瘤组和无胸腺异常组及健康对照组中的差异表达。结果：1．1ncRNA芯片分析显示，重症肌无力胸腺瘤患者组和健康对照比较存在1489个显著差异lncRNA分子，其中218个上调，1271个下II 万方数据博士学位论文中文摘要调；有862个差异的mRNA分子，其中上调的mRNA有249个，下调的mRNA有613个。重症肌无力胸腺无异常患者组和健康对照比较存在342个显著差异lncRNA分子，其中172个上调，170个下调；存在353个差异的mRNA分子，其中上调的mRNA有263个，下调的mRNA有90个。重症肌无力并发胸腺瘤组和重症肌无力胸腺无异常组比较存在281个差异显著lncRNA分子，其中52个上调，229个下调。存在204个差异的mRNA分子，其中上调的mRNA有59个，下调的mRNA有145个。2．在重症肌无力并发胸腺瘤与健康对照组，首先选取差异显著性上调lncRNAoebiotech11933、lncRNAA24P927716和下调显著性lncRNAA21P0010030、lncRNAA21P0002844逐一分析其共表达靶基因、GO和pathway，并采用real．timePCR验证其表达，整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析结果显示，细胞对干扰素1，的响应在重症肌无力并发胸腺瘤发病机制中发挥重要的作用，其次依次为正向调节细胞因子产生、调节平滑肌细胞增殖、细胞因子受体结合等生物学功能。通过cis确定了17个lncRNA在染色体上的调控关系；同时通过trans作用机制分析，构建了CTCF、TAFl等转录因子与差异lncRNA的二元组关系及其网络，与mRNA的共表达关系构建CTCF--1ncRNAoebiotech24272一SOST等三元互相调控网络。3．在重症肌无力胸腺无异常组与健康对照组中，选取差异显著性上调lncRNAoebiotech11933、lncRNAoebiotech03926和下调显著性lncRNAoebiotech02627、IncRNAoebiotech22482逐一分析其共表达靶基因、GO和pathway，采用real．timePCR验证其表达，整体差异lncRNA的GO功和pathway分析结果显示，血小板脱粒化和细胞对干扰素的响应在其中发挥重要的生物学功能，其次依次为调节细胞因子转导、负向调节离子运输、炎症反应、糖皮质激素刺激、调节细胞因子生成过程等生物学功能，通过cis确定了6个lncRNA在染色体上的调控关系；通过trans作用机制分析，构建了CTCF、MYC等转录因子与差异IncRNA的二元组关系及其网络，与mRNA的共表达关系构建CTCF一1ncRNAA21P0007083--NUSl等三元互相调控网络。4．在重症症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组，选取差异显著性上调lncRNAoebiotechl3222、lncRNAA19P00315959III 万方数据博士学位论文中文摘要和下调显著性lncRNAoebiotech22652、IncRNAoebiotech16223逐一分析其共表达靶基因，GO和pathway，采用real．timePCR验证其表达。整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析显示，确定趋化因子受体结合，细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路在其中发挥重要的生物学功能，其次分别是正向调节白细胞的迁移运动，细胞因子转导、离子的运输等生物学功能。通过cis确定了6个lncRNA在染色体上的调控关系；通过trans作用机制分析，构建了CTCFwlncRNAoebiotech22642--SMCR7L等三元互相调控网络。5．整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析结果显示，与健康对照组比较，无论MG是否合并胸腺瘤，细胞对干扰素丫的响应均在发病机制中发挥重要的作用；而MG合并胸腺瘤组与胸腺无．．．异常组比较，趋化因子受体结合，细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路在其中发挥重要的生物学功能，其次分别是正向调节白细胞的迁移运动，细胞因子转导、离子的运输等生物学功能。结论：1．通过lncRNA芯片分析发现了重症肌无力并发胸腺瘤患者组和重症肌无力胸腺无异常组及健康对照组的差异表达的lncRNAs和mRNAs。2．通过分析三组部分差异IncRNA的cis和TF调控关系，确定了lncRNA在染色体上的调控关系。3．通过trans作用机制分析，构建了CTCF—lncI矾Aoebiotech22642一SMCR7L等三元互相调控网络。关键词lncRNA，mRNA，重症肌无力，胸腺瘤，实时荧光定量PCR，生物信息学分析IV 万方数据TheexpressionofdifferenceLncRNAsandthebioinformaticsanalysisinmyastheniagravisAbstractobjectiveThisstudywasaimedtoexplorethedifferenceexpressionoflncRNAsandmRNAamongthemyasthemagravispatientsaccompanywiththymomaornotbylncRNAmicroarraytechnology．WewillpredictthelncRNAs’potentialCO—expressedtargetgenes，biofuncionalclustersandsignaltransductionpathwaysbyusingbioinformaticsmethod．ItwillutilizethemeansofcisandtranspredictiontoanalyzethemechanisminvolvedingeneregulationandthenetworksofTF-lncRNA-targetgene．Real．timePCRwasusedtoconfirmsomeoftheoutstandingdifferentiallyexpressedlncRNAs．Thisstudywillsupportthefoundationtheoryfortheinvestigationofpathogenesisofmyastherfiagravis．Method1．Collectionofperipheralbloodandnormalcontrols．SeparateRNA．samplesofmyastheniagravispatientsthelymphocytesandextractthetotal2．ExplorationthelncIⅢAandmRNAexpressionprofilevialncIⅢAmicroarrayinmyastheniagravispatientsandnormalcontrols．ScreentheoutstandingdifferenceexpressionoflncRNAsandmRNA(differenceratio_>2，pSO．05)．3．Bio·informaticsanalysisincludingpotentialtargetgenesprediction，ENCODEdatabaseenrichedtermsandsignalpathways．ConstructionofnetworksofTF-lncRNA—targetgenes．Predictionofdifferentiallyexpressed1ncRNAtargetgenesviathePearsoncorrelationcoefficient．Associationanalysisforconstructionof1ncRNA．mRNACO-expressionnetwork．AnalysisofTF-lncRNA-targetgenesthreeelementaryrelationshipbyCytoscape．4．VerifythedifferentiallyexpressedlncRNAsbyquantitativereal-timePCR：someofthesignificantlydifferentially—expressedlncRNAsasdetectedbymicroarraywerechosenandconfirmedbyRT-PCR．V 万方数据博士学位论文英文摘要Comparisontheexpressionstatusinthreegroupswitheachother(myastheniagravisaccompanywiththymoma,myastheniagraviswithoutthymomaandnormals)．Results1．UsinglncRNAmicroarray,differentlyexpressedlncRNAsweredetectedasfollows(differenceratio>2，p8000g离心30秒，弃去滤过液。4)、吸取500glBufferRPE到RNeasymini柱子内，>8000g离心洗涤30秒，弃去滤过液，再用500glBufferRPE在>8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2“的套管，将RNeasymini柱子转入一新的1．5mlEppendorf管中。5)、吸取40glRNasefree的水，>_8000g离心洗脱1min。6)、重复步骤5一次。7)、RNA质量检查。样品质检情况2100RIN28S／18S合格>=7．0>=O．7部分降解(情况1)2100RIN>=7．028S／18S<0．7部分降解(情况2)6．0<=2100RIN<7．0⋯⋯降解<6．0⋯⋯2．2．3．2cDNA第一链和第二链一步法合成1)、取0．299RNA于0．2ml离心管中，如下配置反应溶液：200ngtotalRNA(5ngpolyA+RNA)2．5ulSpikeMix2ulrandomPromoterPrmer0．8ultotal5．3ul2)、65℃保温10分钟，冰浴5分钟注意：提前把5×FirstStrandBgffer在80。C预热3-4分钟3)、配置如下cDNA合成体系：CDNAMasterMix．4．7ul1木5*FirstStrandBuffer2ul0．1MDTTlul10mMDntpmix0．5ulAffinityScriptRnaseBlockMix1．2ul4)、将上述4．79Imix加入变性后冰浴的RNA中。5)、用tip混匀，之后离心。6)、PCR-85木10ul5ul2．5ul6ul 万方数据博士学位论文第二章400122hour70℃15minmovetoice5min1、如下配置Transcriptionmix：TranscriptionMasterMix．6ul1木H200．75ul5*Transcriptionbuffer3．2ul0．1MDTTO．6mNTPmixlulCy3．CTP0．21ulT7RNAPolymeraseBlend0．24ul2、加入6plTranscriptionmix并混匀3、PCR：40℃2hours5+3．75ul16ul3ul5ul1．05ul1．2uI2．2．3．4cRNA纯化(QIAGENRNeasy@Minil(it)QIAGENRNeasyMinikit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。1)、加入841．tlRNasefree水，加入350“lBufferRLT并充分混匀。2)、加入250¨l无水乙醇，Tip头充分混匀。3)、将共计700p．1含总RNA的溶液转入套在2“离心管内的RNeasy柱子内，E8000g离心15．30sec，弃去滤过液。4)、吸取500plBufferRPE到RNeasymini柱子内，>_8000g离心洗涤15—30Sec，弃去滤过液，再用500plBufferRPE在>8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasymini柱子转入一新的1．5mlEppendorf管中。5)、吸取30¨lRNasefree的水，静置1min，_>8000g离心洗脱1min。6)、重复步骤5一次。2．2．3．5cRNA浓度测定1)、cRNA质控用分光光度计分析RNA浓度。需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度A260／A280应接近2．0为较纯的I斟A(比值在1．9—2。l也可)2)、按下面的计算公式确定调整cRNA的含量：调整cRNA含量=RNAm-(totalRNAi)(y1RNAm=IVT后测得cRNA量(“g)9 万方数据博士学位论文第二章totalRNAi=开始总RNA的量mg)y=在IVT过程中加入的双链cDNA产物占全部cDNA产物的百分数3)、荧光分子浓度及掺入率计算Cy3-浓度(pmol／I-t1)=A552／0．15Cy3-掺入率(pmoFpg)=Cy3·浓度／cRNA浓度(}tedrtl)2．2．3．6cRNA样品片段化和芯片杂交(4x44Kmicroarrays)l、按下表配制片段化混合液，Fragmentationmix-55m／25ulCRNA10牛BlockingAgentwater25牵FragmentationBuffer然后在60"C温浴30min进行片段化，4"44K1．65ug1lul_÷52．8ul2．2ul2、加入2XGExHybridizationBuffer混匀HybridizationmixCRNAfromFragmentationMix2幸GEHybHi-RPMBuffertotal3、上芯片，65℃17小时，lOrpm滚动杂交2．2．3．7芯片洗涤1、取出芯片于洗液1中洗涤1分钟4"44k55ul110ul冰浴lmin8宰600ng5ul—÷24ul1ul8毒25ul50ul2、再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37"C)2．2．3．8芯片扫描1、Agilent扫描仪中扫描，分辨率为3parl_／5pro，扫描仪自动以100％扫描一次。2．3IncRNA数据分析：2．3．1IncRNA及共表的mRNA均一及差异筛选的方法：均一化：它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的eDNA的拷贝数相等或接近。WEISSMAN早就提出了可以通过基因组DNA饱和杂交的原理将cDNA文库进行均一化的理论。常用策略有基于PCR技术利用eDNA多次复性mRNA．cDNA杂交等。有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达eDNA是处理前的0．3％---2．5o．40，基本满足节约筛选的要求。在本芯片中采用，quantile的方法均一化，过程选择中不执行基准转换码。10 万方数据博士学位论文第二章差异筛选标准：利用t-test不成对检验计算lncRNA及mRNA的显著性水平(Pvalue)和误判率(FDR)，筛选出得到差异表达的IncRNA及mRNA，筛选标准为2倍差异为基准，Pvalue和FDR均<0．05。主成分分析(PCA)通过PCA分析，各组样本分布在二维空间的不同区域，同组的样品在空间分布比较集中，说明这些基因或者lncRNA选取具有代表性。实现该分析的前提条件：需要您指定用于PCA分析的样本和基因或者lncRNA。2．3．2差异基因共表达的筛选方法及共表达模式说明：2．3．2．1差异LncRNAs的共表达基因共表达分析：计算基因的表达相关性(分析得到的是pearson相关系数)，再判断该表达相关性的值是否大于一个事先设定的阈值，用统计方法计算该表达相关性是否显著的高。Correlation皮尔森相关性系数，绝对值达到0．7被认为有相关性，小于．0．7为负相关，大于O．7为正相关。P-value皮尔森相关性P值，P<0．05被认为该表达显著相关。根据上表的计算方法，我们统计三组中不同差异的lncRNA的共表达基因，为了在展示的方便，在本论文中我们，就选取每组中上调和下调的前2位以作为代表。考察差异表达LncRNAs的表达模式，将LncRNAs以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类。2．3．2．2差异整合分析(venn分析)对不同的比较进行交并集分析，找出3组(重症肌无力并发胸腺异常组、重症肌无力无胸腺异常组、健康对照人组)比较之间共同或者各自特有的差异表达基因或lncRNA。2．3．2．3聚类分析：计算多个样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离，再合并、计算，直至只有一类为止，用挑选的差异基因或lncRNA的表达情况来计算样品直接的相关性，一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的基因或IncRNA可能具有相似的生物学功能。实现该分析的前提条件：需要指定用于聚类分析的样本和基因或IncRNA，每一次聚类包含至少3个以上(包含3个)样本，基因数量尽量不要超过1000。在本研究采用MeV软件分析聚类，打开MeV，导入．TET类型数据，采用中位化规范法数据，选择“educationdistance”和“completelinkagecluster”的聚类层次，设置颜色输出参数。 万方数据博士学位论文第二章2．3．2．4关联分析：对指定的lncRNA和mRNA进行关联分析，计算相关系数，根据设定的阈值筛选IncRNA和mRNA关系对，构建lncRNA．mRNA共表达网络。实现该分析的前提条件：该项分析仅针对每组设置三个及以上生物学重复的实验，并需要指定用于关联的样本以及lncRNA和mRNA。2．3．3差异lncRNA的基因功能注释对于每一个差异表达的lncRNAs，计算得到与之共表达的编码基因，筛选出表达显著相关的IncRNA．mRNA关系对，利用成熟的mRNA的功能来推导IncRNA的功能，对异常表达lncRNA显著相关的mRNA进行功能富集分析。功能富集分析的统计学原理是用超几何分布型来检验一组感兴趣的基因中某个功能类的显著性，显著性P值越小，该功能模块有较大的可能与lncRNA相关，从而得到异常表达的lncRNA所参与的生物学过程。同时，为了控制显著性误判的情况，我们引入了假阳性率即FDR的计算，FDR<0．05被认为该功能模块有较大的可能与lncRNA相关2．3．3．1差异表达lncRNAs的表达模式考察差异表达LncRNAs的表达模式，将LncRNAs以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做heatmap。2．3．3．2差异基因的GeneOntolygy(GO)分析对筛选出的差异基因，进行GOanalysis分析，得到差异基因的显著性功能。(1)分别准备上下调的差异基因列表，利用Geneontolygy数据库，选择人的物种，再进行运算，最终得到上(下)调差异基因的功日P-匕p_,列表以及上(下)调基因功能所属基因列表，通过表中的P值和FDR筛选出上(下)调基因的显著性功能，筛选标准为P值=7．0，28S／18S>0．7和260／280>1．6．表1．2结果显示，12个准备上芯片的标本全部合格，随后我们取lggRNA样本在2％的琼脂糖变性凝胶电泳，如图1．1A所示，RNA样本中28S和18S条带清楚，几乎没有5S的降解带出现，说明样本无降解，随后采用HPLC检测其纯度如图1．1B所示，每个样本只28S、18S和5S的3个峰出现，说明样本无其他杂质污染。以上结果表明RNA的样本符合芯片上样的要求以及后面实验的要求。表1．2芯片中重症肌无力及健康对照外周血样本检测结果18 万方数据博士学位论文第三章注：MGl．MG4是胸腺瘤的重症肌无力患者的外周血标本，MG5．MG8是胸腺无异常的重症肌无力患者外周血标本各4例，N1．N4是健康对照z．夕l-周血标本4例，RNA指控标准是：RIN>=7．0，28S／18S>0．7和260／280>1．6．AM～1(jlMCi2M(13～1(i4M(15、一1(i^M(i7卜1l(i8NlN二＼3N4图1-1芯片中重症肌无力及健康对照外周血样本的电泳和HPLC检测。A：芯片中重症肌无力及健康对照样本的电泳图，图中RNA样本中28S和18S条带清楚，几乎没有5S的降解带出现；B：芯片中重症肌无力及健康对照样本的HPLC纯度检测，样本只28S、18S和5S的3个峰出现，样本无其他杂质污染；MGl．MG4是重症肌无力并发胸腺瘤患者的外周血标本，MG5．MG8是重症肌无力胸腺无异常组患者外周血标本4例，N1．N4是健康对照人外周血标本4例19 万方数据博士学位论文第三章1．3重症肌无力及健康对照外周血样本IncRNA芯片及mRNA芯片筛选1．3．1OEBiotechHumanlncRNA芯片V2．0芯片检测采用OE公司最新BiotechHumanIncRNA芯片V2．0高通量筛选重症肌无力及健康对照外周血样本lncRNA及mRNA结果。其芯片操作的参照技术路线的路程和说明书。应用安捷伦公司的芯片扫描仪扫描芯片结果(图1．2)。通过CV值得确定表1．3，以主成分分析(PCA)通过质控检测(图1．3)确证芯片的真实可靠以及实验的正常。MGlMG2MG3MG4MG5N1MG6N2MG7N3图1-2IncRNA芯片扫描结果图20MG8N4 万方数据 万方数据博士学位论文第三章1．3．2lncRNA芯片的数据分析1)初步处理通过安捷伦芯片扫描软件对芯片灰度扫描，扫描图片见图1．2，对扫描结果使用Genomestudio进行分析，得到芯片上每个基因点的原始信号值，用quantile法标准化的信号值，并且经过l092转换，随后将样本进行旗标，P代表信号与背景差异显著，M代表信号与背景差异不显著，A代表介于两者之间。2)差异lncRNA与mRNA的筛选将三组的芯片数据进行比较，利用经随机方差模型修正后的F检验(RVM．Ftest)计算lncRNA与mRNA的显著性水平(Pvalue)并l误判率(FDR)。筛选出得到三组间差异表达的lncRNA与mRNA，统计如表1-4所示。对于生物学重复够做统计分析的组间比较，筛选标准为FC(abs，绝对值差异倍数)大于或等于2且P小于等于0．05，且用于比较的两组数据至少有一组数据75％样本标记为Detected，表2．1、3．1、4．1分别是重症肌无力并发胸腺瘤组与健康对照比较的差异lncRNA，重症肌无力无胸腺异常组与健康对照组比较的差异IncRNA，重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力无胸腺异常组差异lncRNA，为了展示的方便和版面的设计，只展示了差异倍数在3倍以上的lncRNA分子。表1—4差异IncRNA与mRNA的统计注：MGl．MG4是重症肌无力并发胸腺瘤组患者的外周血标本，MG5．MG8重症肌无力胸腺无异常组患者外周血标本4例，NI．N4是健康对照组外周血标本4例22 万方数据博士学位论文第三章第二部分：重症肌无力并发胸腺瘤的IncRNA及mRNA结果分析2．1重症肌无力并发胸腺瘤的差异lncRNA及mRNA通过第一部分的IncRNA芯片和mRNA芯片，我们筛选到一系列的差异分子，在重症肌无力并发胸腺异常组与正常对照组比较，以筛选标准为FC(abs，绝对值差异倍数)大于或等于2且P小于等于0．05，筛选出差异lncRNA上调的有218个，下调的有1271个：mRNA上调的有249个，下调的有613个。如表2．1所示lncRNA的差异，2．2是相应样本的mRNA，为了展示的方便，这里我们只显示了3倍差异以上的分子。表2—1重症肌无力并发胸腺瘤组与健康对照比较的差异IncRNA 万方数据博士学位论文第三章24 万方数据博士学位论文第三章25 万方数据博士学位论文第三章26 万方数据博士学位论文第三章表2．2重症肌无力并发胸腺瘤组与健康对照比较的差异mRNA27 万方数据博士学位论文第三章28 万方数据博士学位论文第三章A_33一P33476971．88E·055．365303downNOVA1JU3一P1689093．75E-045．335122downZFPM2A。33—邱3309582．29E-045．143166downNXNA-33一P32994210．0059485．129407downZNF530√U1一P00139620．0022264．990156downLOCl00506667A-33一P3260108．78E-064．959506downA_24一P9239450．0126264．925479downUBR4A-24一P2889549．43E-054．90712downSRRD√U3一P32402490．0027644．851067downLOCl00129l25A-24』104440．0038054．794744downTTLL6A一33一P35194240．025194．789244downLOC386597八j3j3332292o．0091344．697363downRNASEl2A—33—P32801200．003044．673099downCACNA1BA一2，_P880697．91E·044．622682downLⅧ’PA_23一P338472．02E·044．531498downSYN1A_33一P34176020．0019864．529112downAj3J33661560．0198214．510636downSPATA9AL-33—邱3776440．0174064．482632downZCCHC16久j3j33874200．0036614．463437downPKHDIA-33一P32894464．69E-044．461465downLOC100131048入33一P32364365．46E-05A．455639downC40rf51J堪3一P3129013．63E-064．447742downGPRl12k∞，A51850．0101014．428377downFIGFK卫旦035401．23E·044．375344downEHFA-33一P34176500．004184．317334downKLKl0k登，A00967．28E-044．274982downPROCA33P336492l0．0036274．274579downA_23一P3426410．0028824．212246downSLC44A5入篓，434919Q．0128684．204871downRAB42A33P32270290．0110934．195218downA．-23一P1330362．86E-054．168123downSLC34A2A-32一P2324110．040084．139002downPTCHD2A33P32179330．0044184．115509downAj3j34179200．0191654．057695downAKAP4Aj3-P33227241．35E-064．055575downPOLR3AA_24一P4953672．20E-054．052713downGRXCRIK33一P33945540．0019444．032001downPRAMEF15k33一P33132150．0377144．0276downLRIT229 万方数据博士学位论文第三章A32P3815930．0048254．010137downSLC26A7A23P2128000．0133424．002791downFGF5A23P676460．0091O14．002433downGAPDHSA23Pl370351．89E．043．983425downPIRA23P4261530．008553．96615downCCDC37A23P306930．007843．956122downPLGA33P33917360．009953．948488downA23P86411。84E．053．927278downMY03AA23P2590031．67E．043．888364downPEX5LA23P3146720．01412l3．87214ldownC110rf40A33P33480790．0012693．839304downADIGA23P1671290．0268693．831821downHHIPA33P32312670。0030373．82986downLOC257396A23P2514530．0051313．810289downHNF4GA23P476650．0186733．799747downHBElA33P33657352．58E．053．79816downTHBS2A33P32480522．21E．043．79185ldownNLGN4YA23P1302810。0235393。791428downORlA2A33P34014829．69E．053．786578downA23P3310490．0443663．765599downDPYSL4A33P32596936．93E．053．762232down0R6P1A24P34150．0098833．732292downPPP2R2CA23P3796140。0260623。726179downOIP5A33P34099840．0209663．719993downCDKL4A23P1486090．014533．70635ldownPLAClA23P385670．0156643．684797downSPECClA33P32634591．72E一043．68221downM【PPEDlA33P33304981．86E-043．67041downALDH7A1A23P4307280．0037473．653988downATP4AA23P1449110．0036073．645112downEGFLAMA一24一P'2825470．012813．640495downCFHR4A23P897800．0026923．637309downLANL～3A．．24P2089093．42E-063。630765downTRjM2A23P1048650．0199253．630116downA_23一P501933O．0033113．621788downCA(’NG6A．33一P33691780．029473．610607downPRG4A．-2”6976850．020563．602265downESYT3A_23一P368338O。0162743．596413downBET3L30 万方数据博士学位论文第三章 万方数据博士学位论文第三章A33P377174lA33P3268144A23P615A23P76218A23P203972A23P315964A23P332399A33P3226910A33P3265619A33P3337617A23P53345A23P93960A23P213336A33P3318490A33P3423631A23P110957A33P3324181A33P3398867A23P367420A33P3237096A23P133902A33P3291034A23P212756A23P363878A23P303101A23P131875A33P3268035A23P7498lA23P157736A33P3210800A33P3718679A33P3237379A33P3311046A33P3297562A33P32224390．0127390．0058720．0332770．0326320．0414830．0041230．0285380．0046870．0376280．0072620．0083330．0211420．0161880．0143656．34E．074．10E．041．56E．040．002397．63E．04O．0115390．0059640．0106240．0029380．0016620．0047959．83E．074．11E．049-35E．040．0189970．0159140．0217530．0030490．0027140．007970．0116943．24455l3．2228223．2205793．1911293．1803783．1801443．1693913．1632923．1533923．1518093．1448383．1257113．1241633．1240523．1219883．1153063．1096143．1056353．104753．0932633．0875353．086893．0762663．0754733．0737733．0513l3．0415993．0396063．02933l3．0292833．0214163．0201413．01617l3．0157193．011155downZNF614INSRRDCDFZDlOUMODLlGULPlGRK7ARNTL2PRSS37FGFlPDZRN3、VHSClFOXF2LoC283112GCRG224ADAM21INPP5FPSORSlClCIQTNF8GRK4I心TN2PCDHGC4ANKRD60L忆LlZNF670PPAPDC3LOC283731KCNClOR2M7IIⅨ2TCPl0L232 万方数据 万方数据博士学位论文第三章2l8l27lMGl-4VSNl-4lncRNAMGl_4vsN1．4mRNA2496l3图2-2重症肌无力并发胸腺瘤的差异IncRNA和mRNA的cluster分析左边：重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照组的IncRNAcluster分析右边：重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照组的mRNAcluster分析2．4重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照组差异表达的lncRNA的共表达基因由于IncRNA不编码蛋白，lncRNA的生物学功能的注释因此需要依赖其他方式解释。对于每一个差异表达的lncRNAs，计算得到与之共表达的编码基因，筛选出表达显著相关的lncRNA．mRNA关系对，利用功能熟知的mRNA的功能来推导IncRNA的功能，对差异表达lncRNA的显著相关mRNA进行功能富集分析。从而对差异lncRNA的生物学功能进行注释。在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照组差异表达lncRNA中，上调差异倍数最大的两个lncRNA基因分别是：lncRNAoebiotech11933和IncRNAA24P927716，下调差异倍数最大的两个lncRNA基因分别是：lncRNAA21P0010030和lncRNAA21P0002844。因此，我们对上调和下调差异最大的两个lncRNA分子的共表达基因分析。34加寸z3∽zNZOHz0寸。窆∞o窆加No窆{一。窆∞萝3多N7O1[7n寸。茎_【o窆∞∞望弋No= 万方数据博士学位论文第三章2．4．1上调lncRNAoebiotech11933的共表达基因根据皮尔森相关性，分析在重症肌无力并发胸腺瘤组中差异最大的IncRNA的共表达相关基因，筛选出以p>70％以上的相关基因，为了展示的方便，我们在这里只显示了IncRNAoebiotech11933(表2．3所示)和lncRNAA24P927716(表2．4所示)的p>90％以上的相关基因，其中lncRNAoebiotech11933共表达基因共p>70％以I-．有以GOS2为代表的552个基因，其中lncRNAA24P927716共表达基因共p>70％以上有以NAMPT为代表的496个基因。表2-3上调IncRNAoebiotech一11933的共表达相关基因(p>90％以上的显示)表2．4上调IncRNAA一24一P927716的共表达相关基因(p>90％以上的显示)35 万方数据博士学位论文第三章随后，考察差异表达LncRNAs的表达模式，将上调LncRNAs(oebiotech11933和A24P927716)与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类，图2．3所示，AB盼：I●．0⋯厥上调IneRNAoebioteeh1933隆擀裕鋈爨赫翟骥雕：霞骥稠黜专蘼蕊辆掣爿霾蕊鲤妒黼露霾黼⋯．霞蘑鬻鬣?上调lncRNAA24P927716图2．3上调LncRNAs(oebiotechl1933和A24P927716)与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：上调LncRNAoebiotech11933共表达基因表达模式；B：上调LncRNAA24P927716共表达基因表达模式。2．4．2上调LncRNAsoebiotech11933和A24P927716的生物学功能注释参与的信号通路的关系为了更好的了解上调LncRNAsoebiotech11933和A24P927716的生物学36 万方数据博士学位论文第三章功能，我们把在芯片中与LncRNAsoebiotech11933和A24P927716表达相关的基因进行生物学功能GO分析和pathway分析，从而间接探讨LncRNAsoebiotech11933和A24P927716的生物学功能。2．4．2．1LncRNAsoebiotech11933的共表达基因的GO和pathway分析将与LncRNAsoebiotech11933共表达的基因552个基因导入David在线软件分析GO和pathway，结果显示表2．5(只显示占总比例靠前的20的GO)，发现LncRNAsoebiotech11933不仅与转录调控相关，还与细胞表面受体信号转录、免疫应答、防疫反应、调节细胞增殖、细胞死亡相关的功能。表2-5LncRNAsoebiotech11933共表达的基因的GO分析同样这些与LncRNAsoebiotech11933共表达的基因在信号通路上KEGG分析，结果显示(表2．6)，信号通路主要集中在细胞因子与细胞因子受体结合、37 万方数据博士学位论文第三章MAPK、趋化因子、NOD．1ikereceptor和Toll．1ikereceptor等信号通路。这些生物学功能和信号通路在免疫细胞分化及肿瘤发生发展中都发挥重要的作用，在后面的讨论中我们做了深入的分析，证明LncRNAsoebiotech一11933在重症肌无力并发胸腺瘤的发病机制中发挥重要的作用表2-6LncRNAsoebiotech一11933共表达的基因的pathway分析2．4—22LncRNAsoebiotech11933在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常组的表达验证为了验证芯片的可靠性，随后我们又采用real．timePCR验证LncRNAsoebiotech11933的表达情况是否与芯片一致，在12例重症肌无力并发胸腺瘤患者和8例正常对照的外周血中，结果如图2．4所示，LncRNAsoebiotech11933比正常要高3，8倍，与芯片升高的结果是一致。右边分别是LncRNAsoebiotech11933在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。证明芯片的结果与real．timePCR的结果一致，在重症肌无力并发胸腺瘤患者高表达，提示LncRNAsoebiotech11933促进了疾病的发生和发展。Oebio．11933．／图2-4LncRNAsoebiotech一11933在重症肌无力的胸腺异常组与正常组的表达38^Zo乱《o^i曩-盛暑母P#-Oc—CQ∞mCa甚∞o乏_玛一。匣 万方数据博士学位论文第三章2A．2～LncRNAA一24一P927716的共表达基因的GO和pathway分析同样，将与LncRNAA一24～P927716共表达的基因496个基因导入David在线软件分析GO和pathway，结果显示表2-7(只显示占总比例靠前的20的GO)，发现LncRNAsA__24一P927716与蛋白磷酸化、细胞膜组成及跨膜蛋白、DNA结合、凋亡、细胞因子、炎症反应、蛋白氨基酸的乙酰化等功能。表2．7LncRNAA24P927716的共表达基因的GO分析(排名前20的GO)hsa04060：Cytokine-．cytokinereceptorJtnteractionhsa04062：Chemokinesignalingpathwayhsa04621：NOD．-likereceptorsignalingpathwayhsa04610：Complementandcoagulationcascadeshsa04012：ErbBsignalingpathwayhsa052】9：Bladdercancer15139760．3626690．3143130．2176020．169246O．1692460．1450680．0139960．0056972．87E．040．0120690．0338980．005861hsa04920：Adipocytokinesignalingpathway60．1450680．03831939 万方数据博士学位论文第三章同样这些与LncRNAA24P92771共表达的基因在信号通路上KEGG分析，结果显示(表2．8)，信号通路主要集中在细胞因子与细胞因子受体结合、趋化因子、NOD．1ikereceptor、补体系统等信号通路。与LncRNAoebiotech11933不同的是，LncRNAA24P92771有补体系统的共表达的基因参与及表达调控。有研究结果显示，补体系统也自身免疫性疾病中也发挥重要的生物学功能。同样从这些GO和pathway中，发现LncRNAA24P92771与免疫细胞分化和肿瘤的形成具有重要的作用，在讨论部分我们做了详细的论述。2．4．2．4LncRNAsA24P92771在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常组的表达验证为了验证芯片的可靠性，随后我们又采用real．timePCR验证LncRNAsA24P92771的表达情况是否与芯片一致，在12例重症肌无力并发胸腺瘤患者和8例正常对照的外周血中，结果如图2．5所示，LncRNAsA24P92771比正常要高8．9倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是LncRNAsA24P92771在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。提示高表的LncRNAsA24P92771同样也可能促进疾病的发生。@璧剥一图2-5LncRNAsA24P92771在重症肌无力的胸腺异常组与正常组的表达2．4．3下调IncRNAA21P0010030和A21P0002844的共表达基因及功能注释2．4．3．1lncRNAA一21一P0010030和Ajl一P0002844的共表达基因在MGl．4VSN1．4中差异表达的IncRNA中，下调差异倍数最大的两个lncRNA基因分别是：IncRNAA21P0010030和lncRNAA21P0002844，通过芯片的信号结果及与lncRNA的共表达的相关性分析。我们得到了IncRNAA21P0010030和lncRNAA21P0002844的共表达相关基因，如表2-9和表2．10一一．一--一-—一U．1●●●●●●●●_’．_●J●●■●．1●J工御啪嚣加=2伯521一ZQ也《o^；_墨簋呈母P_cOc一墨罂△×oo>警_誓。笙 万方数据博士学位论文第三章所示，为了显示的方便，我们只显示了p>95％1拘相关基因。表2-9下调IncRNAA一21一P0010030的共表达相关基因(p>95％以上的显示)表2．10下调lncRNAA一21一P0002844的共表达相关基因(p>90％以上的显示) 万方数据博士学位论文第三章随后，考察差异表达LncRNAs的表达模式，将下调LncRNAs(A21P0010030和A21P0002844)与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类，图2-6所示，．7：．⋯。?。一下调lncRNAA一21一P0010030曩鬻F”下调lncRNAA一21一P0002844图2-6下调LncRNAs(A-21-P0010030和√q1一P0002844)以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：下调LncRNAA21P0010030共表达基因表达模式；B：下调LncRNAA21P0002844共表达基因表达模式。2．4．3．2IncRNAA21P0010030共表达基因的GO和pathway分析随后我们将与lncRNAA21P0010030共表达的相关基因的893个基因导入David软件分析。其GO分析结果如图2．11所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接的转导、G蛋白复合受体信号通路、神经系统合成、细胞增殖、细胞调节、调节蛋白催化、神经分化等功能。表2—11IncRNAA21P0010030共表达的相关基因的GO分析42纛糕l 万方数据博士学位论文第三章表2—12下调IncRNAA一21一P0010030的共表达相关基因的pathway分析同样这些与lncRNAA21P0010030共表达的基因在信号通路上KEGG分析，结果显示(表2．12)，信号通路主要集中在神经活化配体受体相互作用、Ca离子信号通路、嗅觉转导、刺激信号和补体系统。与上调的两个差异最大的lncRNA分子相同的是，也有补体系统的共表达的基因参与及表达调控。结果提示，补体系统也自身免疫性疾病中也发挥重要的生物学功能。其具体生物学功能能在后面的讨论中详细阐述。2．4．3．3LneRNAsA21P0010030在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常组的表达验证为了验证芯片的可靠性，随后我们又采用real．timePCR验证LncRNAsA21P0010030的表达情况是否与芯片一致，在12例重症肌无力患者并发胸腺瘤患者和8例正常对照的外周血中，结果如图2．7所示，LncRNAsA21P0010030是正常对照的O．11倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片降低的结果是一致。右边分别是LncRNAsA21P0010030在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。提示LncRNAsA21P0010030的在疾病中低表达，那么升高其表达，或许又能延缓或治疗重症肌无力疾病发生和发展。43 万方数据博士学位论文第三章A_21一P0010030≯／。⋯jp图2—7LncRNAsA21P0010030在重症肌无力的胸腺异常组与正常组的表达验证2．4．3．4lncRNAA-21一P0002844共表达基因的GO和pathway分析随后我们将与lncRNAA21P0002844共表达的相关基因的893个基因导入David软件分析。其GO分析结果如图2．13所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接的转导、G蛋白复合受体信号通路、神经系统合成、细胞增殖、细胞调节、调节蛋白催化、神经分化等功能表2．13IncRNAA21P0002844共表达的相关基因的GO分析一工ot《oo叠奄心簋ciEoc—coI趁A×o02_童。比 万方数据博士学位论文第三章表2-14IncRNAA一21一P0002844共表达的相关基因的pathway分析lncRNAA21P0002844共表达的基因在信号通路上KEGG分析，结果显示(表1-24)，信号通路主要集中在嗅觉转导信号、细胞因子与细胞因子受体结合相互作用、IgA信号网络等。2．4．3．5LncRNAsA21P0002844在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常组的表达验证为了验证芯片的可靠性，随后我们又采用real．timePCR验证LncRNAsA21P0002844的表达情况是否与芯片一致，在12例重症肌无力并发胸腺瘤患者和8例正常对照的外周血中，结果如图2．8所示，LncRNAsA21P0002844是正常对照的0．11倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是LncRNAsA21P0002844在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。同样提示LncRNAsA21P0002844可能是诊断或者治疗重症肌无力的分子之一。A21PO002844●卜--—————==．_———叫●-、／‘··-==j目一图2-8LncRNAsA21P0002844在重症肌无力的胸腺瘤组与正常组的表达45一zQL《o9它西簋uI再PEoc— 万方数据博士学位论文第三章2．5重症肌无力并发胸腺瘤组与正常组incRNA功能预测网络图及统计特征根据上面对lncRNA共表达基因的GO和pathway分析，分析lncRNA与GO功能预测的term之间的关系。对整体差异lncRNA的GO进行分析，选取预测可信度(按P．value排序)最高的Topl00和200个分别预测关系，对其中各个功能预测Term进行频次计数，统计功能注释较多的GOterm，从而反映该实验中得到的差异LncRNAs功能分布的整体情况，其结果如下图2-9，通过整体的IncRNA的GO功能Topl00和200分析结果显示，我们发现排名前二的分别是responsetointerferon-gamma，cellularresponsetointerferon-gamma，而有研究显示干扰素丫在重症肌无力中有重要的作用，再次提示我们的IncRNA可能参与干扰素丫的调节重症肌无力的发生发展，也再次佐证我们的芯片结果与前人的研究结果的重合及可靠性。其他的GOBP分别是正向调节细胞因子产生、调节平滑肌细胞增殖、细胞因子受体结合等。 万方数据博士学位论文第三章AGoBP：侍印∞转l。jrt盯f钎。呻∞mmGOBP：oe璩r燃pID惜etointerferort-gmnr幢GOBP：positivemguhUonofcytoldneproductionGOBP：regulationofsmoothmusclecellproiferationGOMF：che玎∞啪eri§ceptorbindingGOCC：rludeosomeGOBP：nudeosome日s割嗍GOBP：antigenprocessingandpresentationGOBP：pl∞sphand蛐no蛾ol啊蒯酿edsignalingGOBP：negativeregulationofmyeloidcelldifferentiationGOBP：DNApackagingGOBP：chromatlnassemblyofdisassern埘GOBP：chromatinassemblyGOBP：celllJbrresponsetomolecukofbacterialonginGOBP：celumari％=spOrlSetoipopolysacchartdeBGOBP：responseIOinterferon-gamrnaGOBP：ccittresponsetointerferon--gammaGOMF：chemoldnereceptorbirdngGoBP：positiveregulationofcYtoldneproductionGOBP：i'eg删onofsmoothmtlsdecellproliferationGOBP：celularresponsetolipopolysacchaddeGOBP：regulationofinflammatoryresponseGOBP：ntJcIeosomeassemblyGOBP：celulsrresponsetomoleculeofbacterialoriginGOBP：protein-DNAcomplexassemblyGOBP：negativeregulationofiontransportGQBP：hOITteOsttlsiSof蹦扪’befofcelsGOBP：chromalJnassemblyGOBP：antigenprocessingandpreserltaUonGOBP：adilplJveim聃neresponseO24681012▲．．n^h_，^fI^^D^l^·^一—●^●^，．14051015NumberofLncRNAsannotated图2-9重症肌无力并发胸腺瘤与正常组IncRNA功能预测网络图及统计特征2．6LncRNAs与其临近编码基因的基因组共表达精细作图由于IncR_NA的主要生物学功能是参与基因的表达调控，有研究显示，lIlcRNA对其邻近的基因表达的调控作用相对强于空间距离较远的分子，因此，47 万方数据博士学位论文第三章我们针对产生差异的lncRNA分子，搜索其上下游1000k范围内的所有编码基因，相关性p值硎．05，并与该LncRNAs有显著共表达(皮尔森相关性计算)的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该LncRNAs所调控。在重症肌无力并发胸腺瘤与正常对照的1489个差异IncRNA，我们发现17个lncRNA存在cis调控的可能如表2—15。表2．15预测17个lncRNA可能存在的cis的基因lncRNAgeneA21P000158loebiotech23958A24P506977A21P0012982A21P0004888oebiotechl1791oebiotech21891oebiotech16028A21P0014586oebiotech03743oebiotech27978oebiotechl0460oebiotech27627oebiotech19308oebiotech08437A2lP0005124A21P0000597其中A21P0001581与共表达差异23个差异基因在在1号染色体上存在共定位的现象，图2．10所示，图中，横坐标为基因组位置，红色线条(点)标注LncRNAs的基因组位置，括号内为其长度；蓝色线条(点)标注编码基因的位置，rho值为该编码基因与LncRNA表达值之间的相关系数，P值为相关系数的P值。编码基因在纵坐标上的位置代表其与LncRNAs表达相关系数的大小(即相关系数越大，位置越高)，正相关则位于LncRNAs的上方，负相关则位于LncRNAs的下方。48犸扒扒”B¨885432 万方数据博士学位论文第三章图2．10IncRNAA一21一P0001581与共表达差异23个差异基因的cis关系同时我们又采用热图分析lncRNAA_21一P0001581与共表达差异23个差异基因的关系，如图2．11所示，lncRNAA21P0001581在重症表达肌无力并发胸腺瘤中低表达，与其表达方式相的存在LIN004等8个基因与之相同，APHlA等15个基因表达方式相反。图2—11IncRNAA21P0001581与共表达差异23个差异基因热图2．7LneRNAs与通过trans机制调控的靶基因LING040AZ3AFA；攒001CGNSETD日1ADAMTSL4TUFTlMLL丁’1A户H1APRPF3SEMA6CANP32EENSAANP32EMRPL9APHlAPSMB4ENSAC10rr'56THEM4MIRPS21TARS2迄今为止，解读较清楚的trans调控机制均涉及染色质调控复合物、转录复合物，我们在参考Khalil等方法的基础上，计算LncRNAs共表达的编码基因集合与转录因子／染色质调控复合物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与lncRNAs显著相关的转录因子，从而识别可能与lncRNAs联合发挥调控作用的转录因子／染色质调控因子。换言之，我们计算LncRNAs共表达的编码基因，寻找这些基因的转录因子，从而识别可能与lncRNA联合发挥调控作用的转录因子。49●‘．CE‘●O^oI_tvco一_∞一o_I_．oocO一∞∞^芒厶×山 万方数据博士学位论文第三章2．7．1重症肌无力并发胸腺瘤差异转录因子一LncRNAs二元组关系及其网络根据上述方法得到的“转录因子一LncRNAs”二元组关系构成的网络关系，由于有的差异lncRNAs产生的TF．1ncRNA网络一般都比较复杂，选择TF．1ncRNA相关性最强的top100个lncRNAs．TF配对产生一个核心网络(corenetwork)，图2．12所示，与CTCF转录因子存在72个差异的lncRNA与之相互作用。与TAFl存在24个差异lncRNA与之相互作用，与MYC存在4个差异lncRNA与之相互作用。A21P褊j95芽904490。eb00吲10e3ch72298@ebiotⅫ24860oebiotech04250A21—130002151A21P001。0e0。41。zle曲岛261丌呻o∞8。猷。曲一07061。eb㈣e曲02627A33P3227896A21P00086980ebioteclh13疆南IoIech25019MYO“21阳。㈣一0eb|0蛐妊281一。eb僦h1雏弼Po嗍炉P0009894础l呲‰。蛐删懒64A_21p0。嗍A21P0。。4。16oebiotech05566。1一。。一‘⋯1。。。A33P3383169一oebiotech16322A一21C1叼010245oebiotecb一03511一一A21P0009360A，9删2静“_10304A21晶11972cebt01∞h．_03950cTc5。一A_191=叼0e08473：A21Pooo黑咖12853A21_l的001906A21P0010300A21P0001581A2，．1嘲4807105o。b。0Iech一106∞T^F1A21P0012531oel'；413tl—l07874oebiote70％以上的相关基因，为了展示的方便，我们在这里只显示了IncRNAoebiotech11933(表3．3所示)和IncRNAoebiotech03926(表3-4所示)的p>90％以上的相关基因，其中IncRNAoebiotech11933共表达基因共p>70％以上有以GOS2为代表的552个基因，其中lncRNAoebiotech03926共表达基因共p>70％以上有以NAMPT为代表的496个基因。表3-3MG5—8VSNI-4上调IncRNAoebiotech一11933共表达相关基因(p>90％以上的显示)表3-4MG5-8VSNI一4上调lncRNA_oebiotech_03926共表达相关基因(p>90％以上的显示)59 万方数据博士学位论文第三章0．95360．9518040．9508920．950460．9435570．9433580．9398930．9394560．9394160．9373630．9371310．9359950．9347420．9335480．932820．9323090．9314930．9313170．9311450．929580．9283420．9264270．926119O．9217540．9155840．9154490．9145030．9139130．9128810．9119670。9113080．9096110．909250．9079520．9071740．9061460．9051531．57E．061．89E．062．07E．062．16E-064．1E．064．17E．065．58E．065．78E．065．8E．066．83E．066．96E．067．59E．068．35E．069．12E．069．62E．069．98E．061．06E．051．07E．051．09E．051．21E．051．32E．051．5E．051．53E．052．02E．052．93E．052．95E．053．11E．053．22E．053．41E．053．59E．053．72E．054．08E．054．16E．054．45E．054．64E．054．89E．055．15E．0588701026902l479257435008101356515236453383500888701494787130414062801351871022l357684807292021141844635147838767634837418801606224084534l2769409749738843A33P342355lA24P89457A23P207058A23P106002A24P250922A23P166408A33P3364864A33P3364869A23P139669A23P90172A23P153320A33P3277373A23P42257A33P3354823A23P165624A33P329618lA23P306867A23P89589A24P252497A32P87013A23P383422A23P315364A24P314179A24P37409A33P3354607A23P32253A23P252106A33P3316273A33P3419190A23P25566A33P3299416A24P379750A23P209678A24P331128A33P3416767A24P124624A23P64721IER3CDKNlASOCS3NFKB认PTGS2OSMNAM口TNAMPTSLC2A3PPPlRl5AICAMlOSMIEIUBTBDl9TNFAIP6CCL3L3NR4A3PERlTRIBlIL8NFKBIDCXCL2ETS2DUSP2CCL4NFIL3RIPK2CCL3Al啪GPRl83GRASPMXDlPLEKGNAl5MAFGOLRlHCAR30．9048285．23E．052920A24P257416CXCL2 万方数据博士学位论文第三章随后，考察差异表达LncRNAs的表达模式，将上调IncRNA—oebiotech一11933和lncRNAoebiotech03926以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类，图3．3所示，≥嚣；i照；；!；二上调IncRNA—oebiotech-11933j!iii嚣j书’上调IncRNA—oebiotech一03926图3—3上调IncRNA—oebiotech-l1933和IncRNA—oebiotech一03926以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：上调IncRNAoebiotech11933共表达基因表达模式；B：上调IncRNAoebiotech03926共表达基因表达模式。3．4．2上调LncRNAsoebiotech11933和lncRNAoebiotech03926的生物学功能注释参与的信号通路的关系为了更好的了解上调lncRNAsoebiotech11933和lncRNAoebiotech03926，我们把在芯片中与lncRNAsoebiotech1933和lncRNAoebiotech03926表达相关的基因进行生物学功能GO分析和pathway分析，从而间接探讨lncRNAsoebiotech1933和lncRNAoebiotech03926。3．4．2．1上调IncRNAoebiotech11933在重症肌无力胸腺无异常组中的验证由于前面在重症肌无力并发胸腺瘤中也同样存在lncRNAoebiotech11933的差异，因此，其GO和pathway分析分别参考前面表2．5和表2-6。同样，我们也将lncRNAoebiotech11933在重症肌无力胸腺无异常组中进行验证。其结果如下图3．4。在12例重症肌无力患者胸腺无异常患者和8例正常对照的外周血61 万方数据博士学位论文第三章中，结果如图1．19所示，lncRNAoebiotech11933是正常对照的8．2l倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是lncRNAoebiotech11933在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。提示在重症肌无力中不论是并发胸腺瘤还是胸腺无异常组，都存在lncRNA—oebiotech一11933的高表达，提示重症肌无力疾病中发挥重要的作用。其作用十分重要。oebiotech1933图3—4上调IncRNA—oebiotech一11933的在重症肌无力胸腺无异常组中验证3．4．2．2上调IncRNAoebiotech03926的共表达基因及功能注释分析随后我们将与lncRNAoebiotech03926共表达的相关基因的483个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3．5所示，其GO相关的功能在调节转录、调节RNA的代谢、细胞表面受体链接信号转导、免疫反应、细胞死亡、增殖等功能。表3-5IncRNAoebiotech03926共表达的相关基因的GO分析(排名前20)62^Za乱《O^；口嚣呈母量Oc-CQ协m誓口)(O0、二_∞一0y一 万方数据博士学位论文第三章表3-6IncRNA—oebiotech一03926共表达的相关基因的pathway分析与lncRNAoebiotech03926共表达的相关基因的pathway主要集中在NOD．1ike受体信号通路、细胞因子与因子受体相互结合信号通路、趋化因子、p53信号通路、Toll．1ike受体信号通路、凋亡和补体系统(表3．6)。3．4．2．3lncRNAoebiotech03926在重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图3．5。对比12例重症肌无力患者胸腺无异常组与8例正常健康对照组，IncRNAoebiotech03926是正常对照的65．4倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是lncRNAoebiotech03926在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。63 万方数据博士学位论文第三章4爿00oebiotech03926■卜——2巴一_H■-¨k／八图3—5IncRNAoebiotech03926在重症肌无力无胸腺异常中的表达验证3．4．3下调lncRNAoebiotech02627和lncRNAoebiotech22482的共表达基因及功能注释3．4—31IncRNA—oebiotech一02627和lncRNA—oebiotech一22482的共表达基因在MG5．8VSN1．4中差异表达的lncRNA中，下调差异倍数最大的两个IncRNA基因分别是：lncRNA—oebiotech一02627和IncRNA—oebiotech一22482，通过芯片的信号结果及与lncRNA的共表达的相关性分析。我们得到了lncRNA—oebiotech一02627和IncRNA—oebiotech一22482的共表达相关基因，如表3-7和表3-8所示，为了显示的方便，我们只显示了p>95％的相关基因。表3-7下调lncRNA_oebiotech_02627共表达相关基因的表达模式(p>90％以上的显示)^Zo厶《O昌弓O簋uI碍；COcvCQmwm誓Q×O①>-¨_盥0Ⅳ- 万方数据博士学位论文第三章0．9277931．37E．05A21P0013956PPFIA40．9276551．38E．05441457A33P3368339FAM22G0．9272851．42E．0553822A23Pl19611FXYD70．9228031．89E．05l37994A23P348264LETM20。922506l。93E．054928A23P203586NUP980．922251．96E．0527156A33P3287418R’兀)Rl0．9211142．11E．05285659A23P18913OI也V20．9209862．12E．05374383A33P3356210B7H60．9194462．33E．053976A24P122137LIFO．9189342．4E．056366A33P3273623CCL210．9179382．55E．05lE+08A33P3287396LOCl001279400．9175912．6E．056llA23P419156OPNlSW0．9167812．73E．0538942lA33P3220615LIN28B0．9166272．75E．0555105A33P3355743GPATCH20．9156272．92E．0510744A23P18579PT-FG20．9150513．02E．058412A23P97394BCAR30．91470l3．08E．051911A33P3378644PHCl0．9126863．45E．0560680A23P60775CELF50．9123543．51E．0584173A33P3235204ELMOD30．9108493．81E．05135138A23P170901PACRG0．910023．99E．0579586A33P3316878CHPF0．9095934．08E．0579649A23PI160MAP7D30．9084894．33E．05729288A33P3259148ZNF286B0．9071524．64E-05lE+08A33P3258127LOCl00132l880．9070564．67E．05480A23P160177ATPlA40．9057035E．0554386A23P129704TERF2IP0．9055325．05E．05224A33P3336617ALDH3A20．9048885．22E一051447A23P144394CSN20．9042755．38E．051215A23P151778CMAl0．9037985．51E．0592092A23P31532ZC3HAVlL0．9034875．6E一0510809A23P36345STAIml00．9030955．71E．059573A23P72817GEIF30．9028475．78E．0592521A23P38567SPECCl0．9027455．8lE．052006A23P215454ELN0．9025175．87E．0554471A23P109547SMCR7LO．9017956．09E-0530850A23P3963CDR2L65 万方数据博士学位论文第三章表3-8下调IncRNA—oebiotech一22482共表达相关基因的表达模式(p>90％以上的显示)随后，考察下调差异表达LncRNAs的表达模式，将下调lncRNAoebiotech02627和lncRNAoebiotech22482与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类，图3-6所示，A蛋如鼎啊确黯嫩帅·‘帅‘c№I囊辫下调IncRNAoebiotech一02627B鳃搿黼搽》嬲如⋯，《《《攀辨¨端；蜊雌瞎鼯睫蕊涮篇勰瞪辫湘踯m豢瓣嚣。麟粼兰爨戳黜”s黧謦燃黼瓣’麟黼。豳秘髓赫酝港l_．一：瓣磷戳#％茹奠；稿粕⋯z黼黼；嗍n}铀g：％．W；；i；；l；；·?；’下调IncRNAoebiotech一22482图3-6下调lncRNAoebiotech_02627和IncRNAoebiotech一22482以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：下调IncRNAoebiotech02627共表达基因表达模式；B：下调IncRNAoebiotech一22482共表达基因表达模式。3．4．3．2下调lncRNAoebiotech02627共表达基因的GO和pathway分析我们将与lncRNAoebiotech02627共表达的相关基因的730个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3-9所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接信号转导、G蛋白复合受体信号、神经系统、认识、感觉信号、离子运 万方数据博士学位论文第三章输、趋化因子、离子平衡等功能。表3-9IncRNAoebiotech02627共表达的相关基因的GO分析(排名前20)表3_10IncRNAoebiotech一02627共表达的相关基因的pathway分析(排名前20)与lncRNAoebiotech02627共表达的相关基因的pathway主要集中在嗅觉转导、神经配体相互作用、Ca离子信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢。3．4．3．3IncI矾Aoebiotech02627在重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图3．7。对比12例重症肌无力患者无胸腺异常组与8例正常健康对照组，lncRNAoebiotech02627是正常对照的0．052倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是IncRNAoebiotech02627在部67 万方数据博士学位论文第三章分样本中的扩增曲线和溶解曲线。oebiotech02627图3．7IncRNAoebiotech02627在重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证3．4．4下调IncRNAoebiotech22482共表达基因的GO和pathway分析3．4．4．1下调IneRNAoebioteeh22482共表达基因的GO我们将与lncRNAoebiotech22482共表达的相关基因的617个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3．11所示，其GO相关的功能在调节转录、调节RNA的代谢、细胞表面受体链接信号转导、免疫反应、细胞死亡、增殖等功能。表3．11IncRNAoebiotech22482共表达的相关基因的GO分析(排名前20)一工a乱《o6嗣弓m矗呈母—EOc-CQ西俄誓Q×①o、‘-歪。眨 万方数据博士学位论文第三章3．4．4．2下调IncRNAoebiotech一22482共表达基因的pathway分析我们将与IncRNAoebiotech一22482共表达的相关基因的617个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3．12所示，与lncRNAoebiotech一22482共表达的相关基因的pathway主要集中在pathwayincancer、嘌呤代谢。表3-12IncRNAoebiotech一22482共表达的相关基因的pathway分析(排名前20)3．4．4．3IncRNAoebiotech一22482在重症肌无力无胸腺异常中的表达验证其结果如下图3．8所示。对比12例重症肌无力胸腺无异常组和8例正常健康对照组，lncRNAoebiotech22482是正常对照的0．051倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是IncRNAoebiotech一22482在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。69 万方数据博士学位论文第三章oebiotech_22482图3-8IncRNAoebiotech22482在重症肌无力胸腺无异常组中的表达3．5重症肌无力胸腺无异常组与正常组lncRNA功能预测网络图及统计特征根据上面对lncRNA共表达基因的GO和pathway分析，分析IncRNA与GO功能预测的term之间的关系。对整体差异lncRNA的GO进行分析，选取预测可信度(按P．value排序)最高的Topl00和200个分别预测关系，对其中各个功能预测Term进行频次计数，统计功能注释较多的GOterm，以反映该实验中得到的差异LncRNAs功能分布的整体情况，其结果如下图3-9，通过整体的lncRNA的GO功能Topl00和200分析结果显示，我们发现GOBP排名前二的分别是plateletdegramnulation，responsetointerferon—gamma，与重症肌无力并发胸腺瘤一样，有干扰素1，参与其中作用。然而与重症肌无力并发胸腺瘤的不一样的是有血小板脱粒作用也在其中，在排名靠前的GOBP中还发现调节细胞因子转导、负向调节离子运输、炎症反应、糖皮质激素刺激、调节伤口愈合、平滑肌增殖、调节细胞因子生成过程等。GOCC排名靠前的分别是血小板脱粒参与其中，而KEGG信号通路中细胞因子与细胞因子受体的相互作用在Topl00中出现。70●_一Zat《o^；弓。簋uI母——coc-CQ西坦口×99>_兰鬟O眨 万方数据博士学位论文第三章ABC；oBP：regulationofsmoothmusclecellpcoliferatlonGOBP：celMarresponsetomoleculeofbacterialoriginGOBP：p∞州veregulationofcytokine叫咄删onGOBP：regulationofsmoothmusclecellproliferation^S1noft能05101520253035图3-9重症肌无力胸腺无异常与正常组IncRNA功能预测网络图及统计特征A：预测可信度(按P．value排序)最高的Topl00的重症肌无力无胸腺异常组与正常组IncRNA功能预测网络图及统计特征；B：预测可信度(按P-value排序)最高的Top200的重症肌无力无胸腺异常组与正常组lncRNA功能预测网络图及统计特征71 万方数据 万方数据博士学位论文第三章等15个基因表达方式相同。舌昌葛8石g兰罢窆兰三至言苫善苫互图3．11IncRNAA24P506977与共表达差异21个差异基因热图3．7LncRNAs与通过trans机制调控的靶基因PGAM2T日K日P1ARL17ANSFA尺L17BLRRC37A2H2AFVCDC27KIAAl267MRPLl0PPlAk24一P506977PUR日H2AFVPURB8P2SCRN2W010YKT6SP6M^PTN^C^D3．7．1重症肌无力胸腺无异常组差异LncRNAs一转录因子二元组关系及其网络根据根据前面的方法得到的“转录因子一LncRNAs”二元组关系构成的网络关系，由于有的差异lncRNAs产生的IncRNA．TF网络一般都比较复杂，选择LncRNAs．TF相关性最强的top100个lncRNAs．TF配对产生一个核心网络(corenetwork)，图3．12所示，与CTCF转录因子存在60个差异的lncRNA与之相互作用。与MYC存在9个差异lncRNA与之相互作用。与TAFl存在8个差异lncRNA与之相互作用等。图3．12重症肌无力胸腺无异常组差异最大LncRNAs100个TF．1ncRNAs图73 万方数据博士学位论文第三章3．7．2重症肌无力胸腺无异常组差异转录因子_LncI矾As一靶基因三元组关系及其生物学意义根据前面lncRNA与其共表达基因的相关性，在根据lncRNA与转录因子TF的相关性，探索既是lncRNA的共表达基因，同时又是TF的调控靶基因，再又存在lncRNA与TF的调控关系，因此，就存在了转录因子—LncIⅢAs一靶基因三元互相调控关系，由于有的差异lncRNAs产生的三元组网络一般都比较复杂，我们选择相关性最强的top300个lncRNAs．TF．靶基因三元组产生一个核心网络(corenetwork)，图3．13所示，在top300个lncRNAs．TF．靶基因三元组中存在10个lncRNA，以A21P0007083为例，存在“CTCF--1ncRNAA21P0007083—-NUS1”三元调控关系，其具有其下特征：第一，所述靶基因NUSl等22个基因与lncRNAoebiotech24272显著共表达；第二，第三，第四，所述lncRNAoebiotech24272与转录因子CTCF相互作用；在所有LncRNAs显著共表达的基因中，有大量基因是CTCF的靶基因；在所有CTCF的靶基因中，有大量基因与所述LncRNAs显著共表达1西】碓矗【翼oebiotech—。20751西霍工二吸圈『河j二j童∞‘直C鼍iSRCINlSLCl3A5GNATlESR2PCDHl0硒J陋oebiotech—．07061GTF3C5。ebiotech-23755ALG3BNIPlDNMT3AOebiOtech25019USP2RENBPoebiotech—．20171CIS三0五氍枣PRAMELGR6删K5岷捌咖佣一洲铂SMCR7Loebiotech02627PRSS35FNDC5LTBP2EcE2CDKL4WNTllMOVl0L1A—．21—．P0007083oebiotech25571RGS4一BTBDl7TMEMl06C口丑zNF28怕RPRMRAB2BzNF425PHKGl三圆图3．13重症肌无力胸腺无异常组转录因子—LncRNAs一靶基因三元组关系74 万方数据博士学位论文第三章第四部分：重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组的lncRNA及mRNA结果分析4．1重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组的IncRNA及mRNA同样根据第一部分芯片的结果，我们将重症肌无力胸腺瘤组(MGl．MG4组)与重症肌无力胸腺无异常组(MG5．MG8组)比较，以筛选标准为FC(abs，绝对值差异倍数)大于或等于2且P小于等于0．05，筛选出差异IncRNA上调的有52个，下调的有229个；mRNA上调的有59个，下调的有145个。如表4．1所示lncRNA的差异，4，2是相应样本的mRNA，为了展示的方便，这里我们只显示了3倍差异以上的分子。表4．1重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异IncRNA75 万方数据博士学位论文第三章表4．2重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异mRNA4．2重症肌无力胸腺瘤组和重症肌无力胸腺无异常组差异incRNA和mRNA的SAM分析同样利用第一部分的芯片结果，采用SAM软件分析，以大于2倍的显著差异为标准，重症肌无力胸腺瘤患者组(MGl．MG4组)与重症肌无力胸腺无异常患者组(MG5．MG8组)比较存在130个差异显著lncRNA分子，其中123个上调，7个下调。(SAM，FDR<0．05，图4．1右)。76 万方数据 万方数据博士学位论文第三章52229—3．00．O3．0NH∽寸∽④卜∞o茎茎茎茎茎茎茎茎一3．00．03．0HN∽寸∽④t'---。。o毫苫茎毫吝苫茎茎59l45MGl-4VSMG5—8lncRNAMGl．4VSMG5-8mRNA图4．2重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异IncRNA和mRNA的cluster分析左边：重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组的IncRNAcluster分析右边：重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组的mRNAcluster分析4．4重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异表达IneRNA的共表达基因同样对于重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异表达的lncRNA的注释，也是计算得到与之共表达的编码基因，筛选出表达显著相关的lncRNA．mRNA关系对，利用成熟的mRNA的功能来推导lncRNA的功能，对异常表达lncRNA显著相关的mRNA进行功能富集分析。从而对差异lncRNA的生物学功能进行注释。在重症肌无力胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常差异表达的lncRNA中，上调差异倍数最大的两个IncRNA基因分别是：lncRNAoebiotech13222和IncRNAA19P00315959，下调差异倍数最大的两个lncRNA78 万方数据博士学位论文第三章基因分别是：1ncRNAoebiotech22652和1ncRNAoebiotech16223，4．4．1上调IncRNAoebiotech13222和lncRNAA19P00315959的共表达基因根据皮尔森相关性，分析重症肌无力胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常中差异最大的lncRNA的共表达相关基因，筛选出以p>70％上的相关基因，为了展示的方便，我们在这里只显示了IncRNAoebiotech13222(表4．3所示)和IncRNAA19P00315959(表4．4所示)的p>90％以上的相关基因，其中IncRNAoebiotech13222共表达基因共p>70％以上有以CABYR为代表的345个基因，其中IncRNAA19P00315959共表达基因共p>70％以上有以FMN2为代表的89个基因。表4-3MGl．4VSMG5．8中上调lncRNAoebiotech13222共表达相关基因的表达(p>90％以上的显示)表4．4MGl．4VSMG5—8中上调IncRNAA一19一P00315959共表达相关基因的表达(p>80％以上的显示)随后，考察MGl．4VSMG5．8差异中LncRNAs的表达模式，将上调IncRNAoebiotech13222和lncRNAA19P00315959与该LncRNAs显著共表达的编码基79 万方数据博士学位论文第三章因的表达模式做双向聚类，图4．3所示，A；露掰露嚣上调lncRNAoebiotech一13222Bi；；；；；；：；!=；上调lncRNAA-19一P00315959图4—3上调IncRNAoebiotech一13222和IncRNAA_l9一P00315959以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：上调lncRNAoebiotech13222共表达基因表达模式；B：上调IncRNAA19P00315959共表达基因表达模式。4．4．2上调lncRNAoebiotech13222共表达基因的GO和pathway分析及功能注释4．4．2．1上调hlcRNAoebiotech13222共表达基因的GO和pathway分析我们将与lncRNAoebiotech13222共表达的相关基因的345个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4．5所示，其GO相关的功能在细胞内信号、神经系统、细胞粘附、细胞与细胞信号、传输神经冲动、细胞形态。表4-5上调IncRNAoebiotech13222在重症肌无力有无胸腺瘤异常的GO分析(排名前20GO) 万方数据博士学位论文第三章与lncRNAoebiotech13222共表达靶基因的pathway经David分析，仅Nicotinateandnicotinamidemetabolism一个信号通路。4．4．2．2IncRNAoebiotech13222在重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图4．4。在12例重症肌无力并发胸腺瘤和12例重症肌无力胸腺无异常的外周血中，lncRNAoebiotech13222在重症肌无力并发胸腺瘤是12例重症肌无力胸腺无异常的6．3倍，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是lncRNAoebiotech13222在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。4习5oebiotech．．13222．／图4．4IncRNAoebiotech13222在重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中的表达4．4．3上调IncRNAA19P00315959在重症肌无力有无胸腺瘤异常的中的共表达基因的GO和pathway分析4．4．3．1上调IncRNAA19P00315959在重症肌无力有无胸腺瘤异常的中的共表达基因的GO和pathway分析我们将与lncRNAA19P00315959共表达的相关基因的89个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表1．39所示，其GO相关的功能在细胞表面一工Q乱《ooj它西簋uI毋P_cou)Co一∞m誓a×oo>暑耍①蟹 万方数据博士学位论文第三章受体链接信号转导、神经系统、认识、G蛋白复合受体蛋白信号、细胞迁移、运动分化等。lncRNAA一19一P00315959共表达靶基因的pathway经David分析，仅Olfactorytransduction一个信号通路。表4-6上调lncRNAA19P00315959在重症肌无力有无胸腺瘤异常的GO分析(排名前20GO)4．4．3．2IncRNAA19P00315959在重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图4．5。在12例重症肌无力并发胸腺瘤组和12例重症肌无力胸腺无异常组的外周血中，lncRNAA19P00315959在重症肌无力并发胸腺瘤是12例重症肌无力胸腺无异常的2。8倍，P<0。05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是IncRNAA19P00315959在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。82 万方数据博士学位论文第三章]竺60{AJ9一P00315959．夕图4-5IncRNAA19P00315959在重症肌无力并发胸腺瘤组与的重症肌无力胸腺无异常组中的表达4．4．4重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中下调lncRNAoebiotech22652和IncRNAoebiotech16223的共表达基因在MGl．4VSN1．4中差异表达的lncRNA中，下调差异倍数最大的两个lncRNA基因分别是：下调IncRNAoebiotech22652和IncRNAoebiotech16223的，通过芯片的信号结果及与IncRNA的共表达的相关性分析。我们得到了下调IncRNAoebiotech22652和lncRNAoebiotech16223的的共表达相关基因，如表4．7和表4．8所示，为了显示的方便，我们只显示了p>95％的相关基因表4．7MGI．4VSMG5．8中下调IncRNAoebiotech22652共表达相关基因的表达(p>90％以上的显示)83一工D山《oo_弓m簋uI母量oc—Co一仍m誓Q×mm乏_受。箧 万方数据博士学位论文第三章表4-8MG1—4VSMG5-8中下调IncRNAoebiotech一16223共表达相关基因的表达(p>90％v；L上的显示)84 万方数据博士学位论文第三章随后，考察MGI．4VSMG5．8差异中下调倍数最大的LncRNAs的表达模式，将下调lncRNAoebiotech22652和lncRNAoebiotech16223，以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式做双向聚类，图4-6所示，；；；；；；i!；；：；下调lncRNAoebiotech一22652-L=-l：=；i；iii；；；i，i下调lncRNhoebiotech一16223图4-6下调IncRNAoebiotech一22652和IncRNAoebiotech一16223以及与该lncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式，A：下调IncRNAoebiotech22652共表达基因表达模式；B：下调IncRNAoebiotech一16223共表达基因表达模式。4．4．5下调lncRNAoebiotech22652的GO和pathway及基因功能注释4．4．5．1下调IncRNAoebiotech22652的GO分析我们将与lncRNAoebiotech22652共表达的相关基因的361个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4-9所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接信号转导、调节RNA代谢、调节转录、DNA结合、免疫反应、防疫反应细胞内在信号、调节增殖、细胞死亡、炎症反应、细胞程序化死亡等。85一m；萋～一批嘛 万方数据博士学位论文第三章表4-9下调lncRNAoebiotech22652在重症肌无力有无胸腺瘤异常的GO分析(排名前20GO)4．4．5．2下调lncRNAoebiotech一22652的pathway与IncRNAoebiotech一22652在重症肌无力有无胸腺瘤异常的pathway经David分析(表4．10)，有细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、NOD．1ike搜提信号、Toll．1ike信号通路、p53信号通路、补体信号通路等。表4．10下调IncRNAoebiotech_22652在重症肌无力有无胸腺瘤异常的pathway分析 万方数据博士学位论文第三章4．4．5．3IncRNAoebiotech22652在重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图4．7。在12例重症肌无力并发胸腺瘤和12例重症肌无力胸腺无异常的外周血中，lncRNAoebiotech22652在重症肌无力并发胸腺瘤是12例重症肌无力胸腺无异常的0．21，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是lncRNAoebiotech22652在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。oebiotech22652．／图4～IncRNAoebiotech一22652在MG并发胸腺瘤组与MG胸腺无异常组中的表达4．4．6下调lncRNAoebiotech一16223的GO和pathway及基因功能注释4．4．6．1下调IncRNAoebiotech16223的GO分析我们将与lncRNAoebiotech16223共表达的相关基因的296个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4．11所示，其GO相关的功能在免疫反应、防疫反应、调节细胞增殖、细胞死亡、凋亡、炎症反应、程序化死亡等。表4．11下调IncRNAoebiotech_16223在重症肌无力有无胸腺瘤异常的GO分析(排名前20GO)87幻侣伯5O一工Qt《o旦．己西duI母—Pcoc—co一毽Q×oQ>翟豆Q比 万方数据博士学位论文第三章4．4．6．2下调lncRNAoebiotech一16223的pathway与IncRNAoebiotech一16223在重症肌无力有无胸腺瘤异常的pathway经David分析(表4．12)，有细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、NOD．1ike受体信号、Toll．1ike信号通路、p53信号通路、凋亡、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等。表4．12下调IncRNAoebiotech一16223在重症肌无力有无胸腺瘤异常的pathway分析4．4．6．3lncRNAoebiotech16223在重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组中的表达验证其结果如下图4．8。在12例重症肌无力并发胸腺瘤和12例重症肌无力胸腺88 万方数据博士学位论文第三章无异常的外周血中，IncRNAoebiotech16223在重症肌无力并发胸腺瘤是12例重症肌无力胸腺无异常的0．25，P<0．05，两者存在统计学差异。与芯片升高的结果是一致。右边分别是lncRNAoebiotech16223在部分样本中的扩增曲线和溶解曲线。oebiotech16223■卜．L————二—————_|●IIl、≯’图4．8IncRNAoebiotech16223在MG并发胸腺瘤组与MG胸腺无异常组中的表达4．5重症肌无力差异IneRNA及mRNA的整合分析4．5．1重症肌无力差异IncRNA的整合分析我们采用对重症肌无力患者有无胸腺异常与健康对照人的比较后的不同差异分子进行交并集分析，找出上调和下调的IncRNA或者mRNA之间存在的差异和共同差异，在上调的lncRNA分子中，MGl．MG4(并发胸腺瘤的重症肌无力患者组)与健康对照组比较存在218个显著差异IncRNA分子，MG5．MG8(胸腺无异常的重症肌无力患者组)和健康对照组比较，存在172个显著差IncRNA分子，其中两者共同存在42个上调的lncRNA分子(图4-9A和表4．13)。在下调的lncRNA分子中，MGl．MG4(并发胸腺瘤的重症肌无力患者组)与健康对照组比较存在1271个显著差异lncRNA分子，MG5．MG8(胸腺无异常的重症肌无力患者组)和健康对照组比较，存在170个显著差lncRNA分子，其中其中两者共同存在93个上调的分子(图4-9B和表4．14)。89一Za山《o2Do■uI母量Oc—CO一∞m誓a×oo乏_歪。笙 万方数据博士学位论文第三章ABUp·-regulatedlncRNAdown··regulatedlncRNAMG1—4vsN1．4MG5—8VSN1—4MGl．4VSN1．4MG5．8VSN1．4图4-9重症肌无力不患者有无胸腺异常与健康对照人的比较后的不同差异IncRNA分子整合，A：上调差异的IncRNA分子整合，B：下调差异IncRNA分子整合表4．13共同上调的42个差异IncRNA分子整合表90，j9 万方数据博士学位论文第三章表4．14共同下调的93个差异lncRNA分子整合表9l 万方数据博士学位论文第三章A2lP00064435．46E．043．145282downA21P00135290．0036l13．123853downoebiotech2557l0。006033。07477ldownoebiotech05313O．0182813．07177downoebiotech20751O．0314023．059883downA2lP00124354．91E．043．053886downoebiotech247071．08E．042．94577downoebiotech276270。0038552．945414downoebiotech249960．006392．935988downoebiotech040560．02l3592．928844downA2lP00050960．0015222．918769downoebiotech069090．0380372．887967downA21P00147356．96E．042。875422downoebiotech20l716．13E．062．844325downoebiotech048600．0029322．83795ldownoebiotech165838．63E．042．778499downoebiotech101990．007512．77489downA21P0002l780．0234812．760594downA21P00070830．0032332．754835downoebiotech040589．OOE．042．753092downA33P36527300．0104022．732347downA2lP00070120．027742．717649downoebiotech030970．0095682．705649downoebiotechl00760．0042052．705358downA33P3242l097．07E．042．705306downA2lP00l6500．0045522．684984downoebiotech214590．0135842．650339downoebiotechO0064O．0l50012．647464downoebiotech064190．0021272．646282downoebiotech141680．0124162．636948downA21P00076590．0047312．6233downoebiotech015160．0023972．609495downoebioteeh029850．0029862．591508downA2lP000679l0．0072832．56771downoebiotech207030．0016622．566317downA21P00071560．0411722．560087downoebiotech062260．0043672．555585downA23P3707333。19E．052。551044down 万方数据博士学位论文第三章 万方数据博士学位论文第三章4．5．2重症肌无力差异mRNA的整合分析我们采用对重症肌无力患者有无胸腺异常与正常对照人的比较后的不同差异mRNA分子进行交并集分析，找出上调和下调的mRNA之间存在的差异和共同差异，在上调的mRNA分子中，MGl．MG4(并发胸腺瘤的重症肌无力患者组)与健康对照组比较，存在249个显著差异mRNA分子，MG5．MG8(胸腺无异常的重症肌无力患者组)和健康对照比较存在263个显著差异mRNA分子，其中两者共同存在80个上调的mRNA分子(图4．10A和表4．15)。在下调的lncRNA分子中，MGl．MG4(胸腺异常的重症肌无力患者组)与健康对照组比较，存在613个显著差异mRNA分子，MG5．MG8(胸腺无异常的重症肌无力患者组)和健康对照比较，存在90个显著差lncRNA分子，其中其中两者共同存在43个共同下调的分子(图4．10B和表4．16)。△n“Up—regulatedmRNA“down—regulatedmRNAMG1．4VSN1．4MG5．8VSN1．4MG1．4VSN1．4MG5．8VSN1．4图4．10重症肌无力不患者有无胸腺异常与健康对照人的比较后的不同差异mRNA分子整合，A：上调差异的mRNA分子整合，B：下调差异mRNA分子整合表4—15共同上调的80个差异mRNA分子整合表94 万方数据博士学位论文第三章95 万方数据博士学位论文第三章表4．16共同下调的43个差异mRNA分子整合表 万方数据博士学位论文第三章97 万方数据博士学位论文第三章4．5．3重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常的差异IncRNA功能预测网络图及统计特征根据上面对IncRNA共表达基因的GO和pathway分析，分析lncRNA与GO功能预测的term之间的关系。对整体差异lncRNA的GO进行分析，选取预测可信度(按P．value排序)最高的Topl00和200个分别预测关系，对其中各个功能预测Term进行频次计数，统计功能注释较多的GOterm，以反映该实验中得到的差异LncRNAs功能分布的整体情况，其结果如下图4-11，通过整体的lncRNA的GO功能Topl00和200分析结果显示，我们发现GOMF：细胞因子受体结合排名最前，KEGGpathway：细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路，GOBP：正向调节白细胞的迁移运动，细胞因子转导、离子的运输等方面。A∞孵，曲_m枷m∞咿瞳帅I幢OO：C砷■_-q∞■-幛啊—一—-●阳Q澈、—■-—H，—_^00BP：—州■，——■∞Go。C‘v—‘d-幻n—nGoCC．日细—-●陋Ic确—H—n-扫瞳—■d--●j豳·l-埔naal咿．地■■曲时啊_O‘-■h曲■aoBP：瑚■■r憎坤艄协肇讳■—-曲·—曲G晰，嘲—n■k—m_憎dm∞eP●州h_啊GoBP‘即_妇一俺■■瞳∞of"■■oe坤●m啊'岫∞GOBS；p∞●岍啊曩●■∞of向幻■-■o^—i曲GC●BP憎■—懈哺■■啮nor·∞h嘲p—ooBP舅■■l嵋■嘲14=m醵嚆■一h口·啊I确—nGO矗P．稿■辅—■—膏●B∞孵口-啊嘲t—_■●■啊nd-譬嘲自∞’C蟑—●-嘟阳■■憎啊■—rH■啪·GOCC：——一—讨●■—●■GDCC．嘲m'曲—竹_ry鼬_n∞BP．—_●■_叫岫000C嘲0■柚r，'●nooCC．c—q■_mkn_m■_-电a-●倒__●由--啪G∞p-I州_r_岫I一∞州∞BP：砷蚺啊rHl●岍I耐■-e，h州卿■●∞o啦—嘶帕尊懈坶哪—·咄矗h哺■城帅∞脚，。e-●-_州■●哪●b印讳——∞■—●-oDBp神嘲一h●-n●008P：m■-■∞一_‘-■h-■GOBP=|憎■M憎■●■∞耐I∞■__州a∞P、■■响—●_■懒o2心kdko。。‰12¨O5，O15N■■b—olb篙RNk■■叫一图4．11重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常的差异lncRNA功能预测网络图及统计特征A：重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常的差异IncRNA功能预测网络图及统计特征整体的IncRNA的GO功能Topl00分析结果；B：重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常的差异lncRNA功能预测网络图及统计特征整体的IncRNA的GO功能Top200分析结果。9R 万方数据博士学位论文第三章4．6重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异LncRNAs其临近编码基因的基因组共表达精细作图参看结果2．5的方法，针对重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异LncRNAs分子，搜索其上下游100k范围内的所有编码基因，相关性P值<-0．05，并与该LncRNAs有显著共表达(皮尔森相关性计算)的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该LncRNAs所调控。在重症肌无力并发胸腺瘤与正常对照的342个差异lncRNA，我们发现6个IncRNA存在cis调控的可能如表4．17。表4．17预测6个IncRNA可能存在的cis的基因lncRNAGeneoebiotech22652oebiotech01106oebiotechl0460oebiotechl0461oebiotech10462oebiotech1046320743其中oebiotech22652与共表达差异20个差异基因在在4号染色体上存在共定位的现象，图4．12所示，图中，横坐标为基因组位置，红色线条(点)标注LncRNAs的基因组位置，括号内为其长度；蓝色线条(点)标注编码基因的位置，rho值为该编码基因与LncRNA表达值之间的相关系数，P值为相关系数的P值。编码基因在纵坐标上的位置代表其与LncRNAs表达相关系数的大小(即相关系数越大，位置越高)，正相关则位于LncRNAs的上方，负相关则位于LncRNAs的下方，，图4-12oebiotech一22652与共表达差异20个差异基因的cis关系同时我们又采用热图分析IncRNAoebiotech一22652与共表达差异20个差异基因的关系，如图4．13所示，IncRNAoebiotech一22652在重症表达肌无力无胸腺异常组高表达，与其表达方式相的存在C140rf45等17个基因与之相同，ACYPl99 万方数据博士学位论文第三章等3个基因表达方式相反。图4．13IncRNAoebiotech22652与共表达差异20个差异基因热图4．7重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异LncRNAs与通过trans机制调控的靶基因4．7．1重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异转录因子一LncRNAs二元组关系及其网络根据上述方法得到的“转录因子一LncRNAs”二元组关系构成的网络关系，由于有的差异lncRNAs产生的TF．1ncRNA网络一般都比较复杂，选择TF．IncRNA相关性最强的top100个lncRNAs．TF配对产生一个核心网络(corenetwork)，图4．14所示，与CTCF转录因子存在63个差异的lncRNA与之相互作用。与TAFl存在26个差异IncRNA与之相互作用，与MYC存在11个差异lncRNA与之相互作用。100㈣榔Ⅲ∞∞印Ⅲ沁眦Ⅲ㈨嘶卵。m卿Ⅷ㈣吨黧慧麟篙瓣黧瓣一 万方数据博士学位论文第三章．”哆‘““一22642”6“ec?09143oebⅫ。ch磊嘲gch16322A21P0010245／、7、J⋯⋯。7一差一84一!岁堋⋯，◆磊二。一’一二一旦蛳“矗-083184』鳖!墼堕墼一一一一也2t—012853一士}}=—002703蠢至i≤；：：：二：二脚挖研eo÷|、I“o，、--、．i‘矿P000661，∑j—z；!；一：6淞。。。614n—z，)孟，z，s“一21—59函谳oe一2b38iote3c{h*19№30te83h一、ss，。图4．14重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异LncRNAs差异最大100个TF．1ncRNA图4．7．2重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异转录因子．LncRNAs．靶基因三元组关系及其生物学意义根据前面lncRNA与其共表达基因的相关性，在根据lncRNA与转录因子TF的相关性，探索既是lncRNA的共表达基因，同时又是TF的调控靶基因，再又存在lncRNA与TF的调控关系，因此，就存在了转录因子．LncRNAs．靶基因三元互相调控关系，由于有的差异lncRNAs产生的三元组网络一般都比较复杂，我们选择相关性最强的top300个TF．1ncRNAs．靶基因三元组产生一个核心网络(corenetwork)，图4．15所示，在top300个TF．1ncRNAs．靶基因三元组中存在8个IncRNA，以oebiotech22642为例，存在“CTCF．1ncRNAoebiotech22642．SMCR7L”三元调控关系，其具有其下特征：第一，所述靶基因NUSl等20个基因与lncRNAoebiotech22642显著共表达；第二，所述lncRNAoebiotech22642等受转录因子CTCF的相互作用；第三，在所有LncRNAs显著共表达的基因中，有大量基因是CTCF的靶基因第四，在所有CTCF的靶基因中，有大量基因与所述LncRNAs显著共表达101 万方数据博士学位论文第三章CBLN2oebioⅢⅡ宝]砸GTF3C5—面‘；WNTltech09USP2芭盎SORCS2SOSTNUSlMOVl0L1oebiotech．．16922oebiotech18319oebA21P0009360A21PRSS35一题：▲盈_譬7立PCDHl0sMCR7Liotech．．226420245CTCFi[田oebiotech——06898孟【舅0715ALG3TMEMll4EPB41L4BEcE2。NMT3ABNlPlEsR2PHKGlQRFP图4—15重症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力无胸腺异常组差异转录因子．LncRNAs．靶基因三元组关系102 万方数据博士学位论文第四章第四章讨论lncRNA芯片在重症肌无力中研究的创新性随着生物技术的发展，进入21世纪以来，随着人类基因组计划的完成，基因序列数据迅速增长。如何研究如此众多的基因在生命过程中担负的功能成为一个重要课题，基因芯片正是在这样的背景下应运而生【24，25，261。基因芯片是基因突变分析、基因测序、基因表达研究的高效手段之一，是生物芯片技术中最基础、发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的产[27,28,29】。长链非编码RNA(IncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平【30】。目前国内LncRNA的芯片研究公司十分的有限，主要有以下几个：使用Arraystar公司的LncRNA芯片进行研究，大概覆盖3万多条人的lncNA数据库，目前康成生物可提供该项服务。还有可以利用agilent的G3版的全基因表达谱芯片来进行LncRNA研究，可覆盖7千多条LncRNA。还有上海SBC利用agilent定制表达谱芯片平台提供的LncRNA芯片服务，大约覆盖3万条LncRNA。另外还有上海晶能生物采用illumina高通量测序平台成功开发的LncRNA测序服务，不仅可覆盖数据库里已有的所有LncRNA，还可以覆盖大量未知的LncRNA，总计可覆盖7．8万条LncRNA，适合所有具有精细基因组图谱的物种，而在本项目研究中，我们采用的是OEBiotechHumanIncRNA芯片V2．0，改芯片包含lncRNA46506条和mRNA30656条，覆盖了8个数据库(agilent、3、．、．ncRNAlncRNAdbGencodeV1HinvDBNONCODEV3、RefSeq、Ultra-conservedregionencodingLncRNAs(ucR)、UCSClncRNAsTranscripts)最新lncRNA，是目前涵盖IncRNA序列最全面的一款产品，数据采集于2012年5．8月，为了便于研究者使用，该lncRNA芯片同时针对lncRNA和mRNA进行检测，包括约lncRNA46506条和mRNA30656条检测的探针，是目前IncRNA探针涵盖最为宽广的的IncRNA芯片之一，同一张芯片检测就能同时发现差异表达的lncRNA和mRNA，并挖掘二者之间的关联。芯片采用4xlSOK格式，在充分保证探针容量和重复数量(IncRNA和mRNA检测探针均重复2次或以上)的前提下，降低了芯片成本和实验费用，并且实验样本可以同时兼顾检测lncRNA的表达和mRNA的表达，这样减少由于样本个体差异存在的误差。IncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能【3¨。哺乳动物基因组序列中4％．9％的序列产生的转录本103 万方数据博士学位论文第四章是lncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1％)，越来越多的证据表明，一些复杂疾病的发生与之密切相关p2，33,34,351，例如：心肌梗死、白血病、Alzhemier病以及多种实体肿瘤。目前研究的热点就是肿瘤中lncRNA的异常表达，但是，目前对于IncRNA的致病机制还知之甚少【36】，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色和发挥的具体功能尚不完全明确，有待进一步研究。虽然近年来关于IncRNA的研究有一定的进展。研究表明，在肿瘤细胞中，某些特定的lncRNA的表达水平会发生改变【371。这种表达水平的变化能够作为癌症诊断的标志物和潜在的药物靶点【38，391。例如在AIiFaghihi等的研究中，在阿兹海默症的研究中找到的一个lncRNA，BACElAS，它编码p分泌酶基因的反义链RNA。p分泌酶能够产生B淀粉样蛋白，后者的累积是阿兹海默症的主要诱因。作为BACEl反义链的BACElAS能够在各种外界压力刺激条件下，增加BACElmRNA的稳定性(通过防止BACEl受到核酸酶降解的方式)，从而导致更多的13淀粉样蛋白累积，并促进BACElAS的表达，这个正反馈循环将会加速阿兹海默症的发展。但是，当使用了特异性针对BACElAS的siRNA降低BACElAS的表达水平后，B淀粉样蛋白的表达水平也同时下降了，这表明BACElAS是一个非常理想的治疗阿兹海默症的药物靶点【40'411。在肝癌的研究中，Yuan等研究结果显示，长非编码RNAMVIH与肝癌病人的微血管侵润密切相关，高表达IncRNAMVIH的病人其微血管侵润分布多且临床级别越高，病程越恶劣，外源性的IncRNAMVIH能够影响血清中PGKl的表达水平以及肿瘤组织中的微血管的密度142|。随着研究和认识的进一步深化，lncRNA与发育性、免疫性疾病的关系逐渐引起注意，PengXeta1．通过高通量测序及基因芯片技术对系统性红斑狼疮(SLE)的非编码RNA表达情况在全基因组水平进行分析，检测正常对照组、SLE活动组、SLE稳定组及RA组受试者PBMC中基因与IncRNA表达，发现其中一部分具有明显差异性，结合生物信息学，探讨了可能与SLE发病及疾病活动性相关的30个特异表达lncRNAs，如uc003wba、uc003wbg、uc003vzw、uc003wbj、uc01010p在SLE活动组及稳定组患者中均高表达，它们位于编码T细胞D受体的基因座内，而T细胞B受体与SLE有关，可能参与狼疮的发病；uc003kot等可能与SLE疾病活动性密切相关143J。这些lncRNAs分别与氧化应激、丝氨酸．苏氨酸激酶、线粒体p．氧化、过氧化物酶、锌指蛋白、组蛋白修饰、高迁移率组20A、蛋白激酶、干扰素受体1等SLE的易感基因相关，通过参与NK介导的细胞毒性等信号传导过程，影响免疫系统功能。在多发性硬化中近年来有研究提出，其发病与异常活化的CD8+T细胞密切相关。多发性硬化为中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，发病机制迄今不明，考虑与病毒感染与自身免疫反应、遗传因素及环境因素均有关。而lncRNA参与了CD8+T细胞的分化及激活过程【44,45】。鼠TEA104 万方数据博士学位论文第四章启动子转录的IncRNA即参与了下游靶基因的调节，调控T细胞分化。在人体内，IL2RA的基因转录的数种lncRNA之一，可能与MS易感性相关。而由细胞因子基因簇转录的hlCIⅢA——砌柳豫J已被证实在鼠Theiler脑脊髓炎病毒(TMEV)的持续性感染中起重要作用【4酬，而TMEV感染正是因其典型的慢性炎症性脱髓鞘、树突凋亡及轴索变性而成为MS研究的实验模型之一。然而lncRNA在重症肌无力还没有研究。目前在重症肌无力的研究中非编RNA的研究非常少，通过文献检索，仅发现3篇文章报道，在重症肌无力的研究中仅有2篇文献报道了miRNA参与发病机制的调控关系。分别是Lin等通过miRNA芯片筛选let．7在重症肌无力的外周血淋巴细胞中低表达，let．7能够靶向调节ILl0的表达从而参与重症肌无力的发病机制调峭J；另外就是Cheng等发现miR-320能够直接靶向调节MAPKl从而影响ERK／NF．1CB信号通路147J。以及我们科室的李静老师组对血R．155的研究，在重症肌无力中，miR-155呈现高表达趋势，且地塞米松对重症肌无力的B细胞中miR．155的表达水平具有抑制作用，但是地塞米松处理对B细胞的中的CD80和CD86经流式细胞检测没有明显的改变【l01。而lncRNA在重症肌无力的研究还没有报道，因此本研究在重症肌无力的非编码RNA的研究中具有创新性。IncRNA在重症肌无力中的异常研究重症肌无力(MyastheniaGravis，MG)是一种公认的自身免疫性疾病【1’2，18J，但自身免疫反应的起源机制迄今未明。由于很大部分MG患者伴有胸腺异常(胸腺瘤或胸腺增生)，以及胸腺切除后可使部分患者症状缓解或部分缓解【3J，因此长期以来，人们一直认为胸腺与MG的发病密切相关，甚至认为胸腺有可能就是MG自身免疫反应发生的起源器官【4J。但在临床上往往出现胸腺切除效果并不理想、甚至胸腺切除后症状加重的现象，不同病理改变的胸腺，MG的临床表现、对药物治疗的反应、胸腺切除后的效果、预后等都会出现差别。究其原因，关键在于MG发病“胸腺起源学说”尚缺乏重要的理论依据，胸腺在MG发病中的确切作用仍有争议，仍不能肯定胸腺在MG发病中是原发作用还是继发作用【4J。因此，深入研究胸腺在MG发病中的作用，无疑具有重要的理论和实际意义。重症肌无力并发胸腺瘤组整体差异比重症肌无力胸腺无异常组的差异多在本研究中，我们首先将重症肌无力标本区分为并发胸腺瘤组和胸腺无异常组，及健康对照组，采用欧易公司最新的lncRNA芯片，分别检测IncRNA的表达和mRNA的表达，整体差异结果显示如表1．4所示，重症肌无力并发胸腺瘤组比重症肌无力胸腺无异常组的差异要多，而整体重症肌无力不分胸腺异常的差105 万方数据博士学位论文第四章异则处于中间，重症肌无力胸腺无异常差异最少，其重症肌无力并发胸腺瘤组的差异mRNA最多有862个，整体不分胸腺有无异常差异mRNA其次有479个，而重症肌无力胸腺无异常组差异mRNA最少是353个，同样差异lncRNA的趋势也是同样的表现，其重症肌无力胸腺异常组的差异IncRNA最多有1489个，整体不分胸腺有无异常差异IncRNA其次有578个，而重症肌无力胸腺无异常组差异lncRNA最少是342个。其可能原因是随着重症肌无力的病程恶化的结果，有关资料显示，约75％的MG患者胸腺异常，其中85％为胸腺增生，15％为胸腺瘤。另外33％75％胸腺瘤患者合并MG。重症肌无力的发生和发展经历着一个胸腺器官病变的过程，随着病变的过程加剧，重症肌无力并发胸腺瘤的出现，因此，其基因表达调控的差异也会越来越大，我们的芯片的结果中也体现了重症肌无力并发胸腺瘤组比重症肌无力胸腺无异常组的差异lncRNA和mRNA要多。重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照组差异在重症肌无力并发胸腺瘤组与正常对照的差异筛选中，我们分别挑选了上调差异最大的两个lncRNA(IncRNAoebiotech11933和IncRNAA24P927716)以及下调差异最大两个lncRNA(A21P0010030和A21P0002844)，分别采用real．timePCR验证其芯片的一致性，real．timePCR的验证结果再次证实芯片结果的可靠性，随后我们又采用皮尔森相关性分析与lncRNA共表达的基因的GO和pathway分析，从而对单个IncRNA的生物功能进行注释，并分析其单个lncRNA参与重症肌无力病程发展的可能作用，在IncRNAoebiotech1933的共表达基因显示与炎症反应、免疫反应、防御反应、调节细胞增殖、负向调节细胞凋亡、负向调节细胞死亡等于凋亡增殖的基因功能相关，信号通路主要集中在细胞因子与细胞因子受体结合、MAPK、趋化因子、NOD．1ikereceptor和Toll．1ikereceptor等，染色体上的位置结果显示IncRNAoebiotech11933与GOS2在染色体存在共表达现象。而我们芯片中的结果也同样显示在，差异的mRNA中，GOS2也是差异表达最大的基因之一，因此再次证明芯片的可靠性。由此我们也推测lncRNAoebiotech11933的生物学功能可能与GOS2相关。有研究结果显示，GOS2G0／G1switch2基因是调节细胞周期的重要基因，在调节细胞周期及细胞增殖方面起着重要作用，研究表明该基因还具有参与调节细胞分化作用【4引。Welch,C等结果显示GOS2编码一个线粒体蛋白，特别是与bcl2和促进细胞凋亡，在人的多种癌细胞中，外源性表达GOS2能够诱导凋亡，并且能能沉默内源性的GOS2的表达，得出结论有n师．alpha诱导的通过NF．kappaB通路诱导的GOS2分子能够拮抗bcl2和促进细胞凋亡1491。Salakou等发现MG患者胸腺中的Bcl2的水平明显高于阴性对照组，阳性胸腺组织的重量明显比阴性胸腺组织的重量要重，Bcl2基因下调可能破坏胸腺细胞的分化，导致细胞死亡减少，细胞大量超 万方数据博士学位论文第四章长存活，从而导致胸腺的增生以及胸腺瘤的产生，Bax的mRNA及蛋白质能够促进MG淋巴细胞凋亡，Bax与bcl2的比例可以上调caspase3从而激活和调节进展相关细胞的凋亡【5⋯。因此，我们可以推论，如下图4．1所示，IncRNAoebiotech1933与GOS2在染色体存在共表达，lncRNAoebiotech1933可以调控促进GOS2的表达，而GOS2可以与bcl2相互作用，拮抗bcl2的表达，下调的Bax与bcl2能够上调caspase3从而激活和调节进展相关细胞的凋亡，从而促进MG胸腺的异常增生或者胸腺瘤的形成。／、／也U＼／m=引吼∞h一11933图4一-IncRNAoebiotech_l1933可能参与的调控通路LncRNAA24P927716共表达的基因496个基因GO显示与螯合作用、DNA结合、凋亡、细胞因子、炎症反应、蛋白氨基酸的乙酰化等功能相关，信号通路主要集中在细胞因子与细胞因子受体结合、趋化因子、NOD．1ikereceptor、补体系统等信号通路。与LncRNAoebiotech11933不同的是，LncRNAA24P92771有补体系统的共表达的基因参与及表达调控。有研究结果显示，补体系统也自身免疫性疾病中也发挥重要的生物学功能。我们发现与LncRNAA24P927716共表达的基因相关性靠前且pvalue最小的是NAMPT基因，烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephospho．ribosyltransferase，Nampt)是烟酰胺生物合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)途径中的关键限速酶。又被称为前B细胞克隆增强因子(pre．Bcellcolonyenhancingfactor,PBEF)和内脏脂肪素(visfatin)t”1。Nampt最初于1994年被Samal等命名为前B细胞克隆增强因子(pre．Bcellcolony．enhancingfactor，PBEF)，它由骨髓基质干细胞中活化的淋巴细胞分泌，协同IL．7和干细胞因子，刺激早期B细胞的形成107 万方数据博士学位论文第四章【521。许多研究结果表明，Nampt是一个促炎症反应因子。在嗜中性粒细胞中Nampt被IL．1B上调，对多种炎症刺激物反应【531。而在CDl4+单核细胞中，Nampt通过p38和MEKl途径诱导IL．1．B、TNF．伍，尤其是IL．6的产生。它还增加协同刺激分子CD54、CD40和CD80在细胞表面的表达。在体内，Nampt诱导BALBPc小鼠血液循环中的IL．6的生成【54，55】。因此，我们猜想LncRNAA24P927716可能通过调控Nampt的表达，从而促进重症肌无力的发生和发展。下调lncRNAA21P0010030共表达的相关基因的893个基因GO相关的功能在细胞表面受体链接的转导、G蛋白复合受体信号通路、神经系统合成、细胞增殖、细胞调节、调节蛋白催化、神经分化等功能。信号通路主要集中在神经活化配体受体相互作用、Ca离子信号通路、嗅觉转导、刺激信号和补体系统。与lncRNAA21P0010030共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是MASlL、ITSNl。MASlL基因编码一类七个横跨膜的G蛋白耦合的受体【56|。编码的蛋白质受体血管紧张素(1-7)矛FI主体的复合Gq蛋白，激活磷脂酶C信号通路。编码的蛋白质可能扮演一个角色在多个进程包括低血压、平滑肌松弛和阿司匹林预防心血管疾病的作用，介导血管紧缩素的影响．(1．7)【5‘71。ITSNl这个基因编码的是细胞质膜相关蛋白和内吞作用的膜蛋白。此外，该编码的蛋白质可能调节囊泡形成的网格蛋白，可以参与突触囊泡回收。这个蛋白质已被证明与多种蛋白CDC42，SNAP23，SNAP25，SPIN90，EPSl5，EPNl，EPN2，和STN2等相互作用。RussoA等研究结果显示，在原发性神经母细胞肿瘤和肿瘤细胞株中ITSNl是维持细胞生长的重要因子之一，沉默ITSNl后能够在体外显著抑制肿瘤细胞骨架生长和肿瘤的形成，过表达ITSNl的靶基因P13K．C213后，能够拯救被ITSNl沉默的细胞，展示了ITSNl．P13K．C213在神经母细胞瘤中的重要性【5引。MaY等在神经胶质细胞中采用siRNA技术沉默ITSNl基因，结果显示能够诱导细胞的凋亡，同时也发现凋亡信号通路上的重要分子女IJ：FAK，Akt，Bcl．2，BAD等在沉默ITSNl后发生改变【591。提示lncRNAA21P0010030可能与肿瘤的发生发展密切相关，在重症肌无力的发展中，lncRNAA21P0010030可以诱导胸腺瘤的形成以及恶化，从而导致重症肌无力的恶性循环。lncRNAA21P0002844共表达的相关基因有608个基因，其GO相关的功能在细胞表面受体链接的转导、G蛋白复合受体信号通路、神经系统合成、细胞增殖、细胞调节、调节蛋白催化、神经分化等功能，信号通路主要集中在嗅觉转导信号、细胞因子与细胞因子受体结合相互作用、IgA信号网络等。与IncRNAA21P0002844共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是ALG2、LHFP。ALG2基因编码一种糖基转移酶家族的成员，该蛋白作为a1、3甘露醇转移酶的作用，l型GIcNAc转移酶二磷酸多萜醇和II型GIcNAc转移酶108 万方数据博士学位论文第四章二磷酸多萜醇成Ⅲ型GIcNAc转移酶二磷酸多萜醇，这种基因缺陷与先天性障碍综合征有关160J。整体重症肌无力并发胸腺瘤组的GO分析发现，responsetointerferon—gamma，cellularresponsetointerferon．gamma等功能排名位居前二。Youngner等在1973年发现16¨，淋巴细胞培养上清中存在一种物质，其来源与抗原性不同于以往发现的干扰素，因此命名为Ⅱ型干扰素，1980年统一命名为干扰素吖(IFN吖)，IFN．丫能够与细胞膜上的IFN吖受体结合，通过激活Jakl和Jak2激酶，激活磷酸化STATl，并使之聚合成二聚体转运至核内，激活主要组织相容性复合物．II的基因的转录及其他效应。IFN-7主要有活化的T-辅助细胞(Thl)表达，具有多种免疫调节功能162，够】：(1)能够通过上调淋巴细胞或诱导抗原提呈细胞MHC．II类分子的表达来促进抗原提呈和特异性免疫细胞识别；(2)促进巨噬细胞FC端受体的表达并激活巨噬细胞；(3)参与B细胞免疫应答。对于重症肌无力，IFN吖在诱导T细胞和B细胞活化增殖并辅助AChRAb、诱发重症肌无力临床症状的过程中起重要作用【17，矧。Wang等在C57BL／6(B6)的EAMG动物模型中敲除IFN吖，发现anti．AChRCD4+T细胞，虽然基因敲除小鼠也能够促进EAMG动物的重症肌无力的发生发展，但是他们相对于野生型老鼠，其症状和病情较轻。NK，NKT,CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)T调节性(Treg)细胞都要比野生型的小鼠水平低，并且来自基因敲除小鼠的Treg细胞的活性也低于野生型16引。TuzunE等发现重症肌无力患者在采用tanercept治疗前的IL6和IFN的水平低，其治疗其治疗效果要优于治疗前IL6和IFN的患者【66J。通过lncRNA的共表达基因的功能分析显示IFN在差异lncRNA中将发挥重要的生物学功能，而前期的研究也发现IFN-7在重症肌无力的重要作用于我们的差异筛选吻合。因此，我们设想差异的IncRNA将在对IFN吖的调控上发挥重要的作用，从而调控重症肌无力的发生发展。重症肌无力胸腺无异常组与正常对照组差异在重症肌无力胸腺无异常组与正常对照的差异筛选中，我们分别挑选了上调差异最大的两个lncRNA(1ncRNAoebiotech11933和incRNAoebiotech03926)以及下调差异最大两个IncRNA(oebiotech02627和oebiotech22482)，同样我们采用real．time验证其表达的可靠性，采用皮尔森相关性分析与IncRNA共表达的基因的GO和pathway分析，从而对4单个lncRNA的生物功能进行注释，并分析其单个IncRNA参与重症肌无力病程发展的可能作用，其IncRNAoebiotech1933余前面的重症肌无力的胸腺瘤组一样，其在这里就不在做详细阐述。上调IncRNAoebiotech03926共表达的相关基因的483个基因导入David软件分析。其GO分析结果如前面结果所示，其GO相关的功能在调节转录、调 万方数据博士学位论文第四章节RNA的代谢、细胞表面受体链接信号转导、免疫反应、细胞死亡、增殖等功能。pathway主要集中在NOD．1ike受体信号通路、细胞因子与因子受体相互结合信号通路、趋化因子、p53信号通路、Toll．1ike受体信号通路、凋亡和补体系统。与lncRNAoebiotech03926共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是TNF、bcl2、ILlB，这三个基因在前的研究与重症肌无力密切相关。通过前面的分析，TNF、bcl2在重症肌无力中发挥重要的生物学功能。同样，ILlB等促炎因子在重症肌无力的研究非常的多，有研究结果显示IL．1能够促进胸腺细胞和T细胞的增殖，增加IL．2受体的表达，分泌IL．2、IL．4、IL．6；诱导B细胞产生对IL．2、IL．4、IL．5、IL．6的反应的能力，增强NK细胞活性。研究发现IL．1D的基因多态性与人类MG有关，MG患者胸腺中的IL．1p表达增高【6列。在下调lncRNAoebiotech02627共表达的相关基因的730个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3-9所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接信号转导、G蛋白复合受体信号、神经系统、认识、感觉信号、离子运输、趋化因子、离子平衡等功能。pathway主要集中在嗅觉转导、神经配体相互作用、Ca离子信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢。与lncRNAoebiotech02627共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是OR51M1、SERPINB5、FZDl0。有研究显示OR51M1是与嗅觉相关的基因。而SERPINB5是一个卵白蛋白，FZDl0是一个卷曲蛋白家族中的成员之一。虽然我们验证了IncRNAoebiotech02627在重症肌无力中存在差异表达，但是目前我们从与之共表达的基因分析，发现与之共表的P．value最小的三个基因分别是OR51M1、SEI冲INB5、FZDl0都与重症无力没有直接的联系或者是研究，因此，其生物学功能还有待探索。lncRNAoebiotech22482共表达的相关基因的617个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表3．11所示，其GO相关的功能在调节转录、调节RNA的代谢、细胞表面受体链接信号转导、免疫反应、细胞死亡、增殖等功能。pathway主要集中在pathwayincancer、嘌呤代谢。与lncRNAoebiotech22482共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是CACNAlB、GAL、LPHN2。CACNAlB基因编码一种N．端压敏电压依赖性的Ca离子通道蛋白的核心成分。能够调控神经元释放神经递质，它能够与0【．2，D，及6亚单位组成高压敏离子通道。虽现在没有直接的研究结果显示重症肌无力与离子通道有关，但是在重症肌无力的发病机制，由于突触后膜的乙酰胆碱受体与乙酰胆碱的结合受阻碍后，会导致前面Ca离子通道的信号传导，Ca通道在神经元信号的传递和动作电位的产生中扮演重要的角色，那么Ca离子信号通路受阻也是肌无力现象的重要环节之一。在Gonzalez的研究中，构建了脊髓和小脑缺失了P／Q．型Ca离子通道的基因缺失110 万方数据博士学位论文第四章小鼠，基因缺失的小鼠在NMJ免疫反应性和不改变自发乙酰胆碱释放上都要比野生型的小鼠低，但是在N．型Ca离子通道却不存在差异，揭示运动神经元病是由于早期的致病基因，同时更进一步说明了自身免疫可能是ALS致病一个机制之一16引。GAL(galanin,甘丙肽)是小的神经肽，是由30个氨基酸组成的神经肽，其C端和N端分别为丙氨酸和甘氨酸残基。在中区神经系统和周围神经细胞作为细胞信号转导分子，起不同的调节生理功能的作用。广泛分布于中枢和外围神经系统，参与调节内分泌、痛觉、神经保护、学习与记忆等多种生物学功能，与阿尔茨海默(Alzheimer’Sdisease，AD)发病机制、神经元发育和再生及神经损伤引起的痛觉密切相关16引。同时也有研究显示甘丙肽与癫痫的发病有密切的关系p01。在重症肌无力胸腺无异常组中的GO整体分析中，GOBP排名前二的分别是plateletdegramnulation,responsetointerferon—gamma,与重症肌无力并发胸腺瘤一样，有干扰素Y参与其中作用。然而与重症肌无力并发胸腺瘤的不一样的是有血小板脱粒作用也在其中，在排名靠前的GOBP中还发现调节细胞因子转导、负向调节离子运输、炎症反应、糖皮质激素刺激、调节伤口愈合、平滑肌增殖、调节细胞因子生成过程等。重症肌无力并发胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组差异在重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力胸腺无异常组之间差异，我们同样也挑选出最大差异的上调和下调的2个IncRNA分子，其中上调差异最大的分子是：IncRNAA21P0006604，由于其定位于Y染色体上，因此，为了排除性别的差异，我们挑选上调差异仅次于A21P0006604的分子：lncRNAoebiotech13222和lncRNAA19P00315959分别验证其表达。下调差异lncRNA分别挑选lncRNAoebiotech22652和IncRNAoebiotechl6223验证。lncRNAoebiotech13222共表达的相关基因的345个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4．5所示，其GO相关的功能在细胞内信号、神经系统、细胞粘附、细胞与细胞信号、传输神经冲动、细胞形态。与IncRNAoebiotech13222共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个基因分别是CABYR、DCTN5、ZNF510。CABYR，钙结合蛋白酪氨酸磷酸化调节纤维鞘。最初报道是睾丸中表达，随后研究显示在脑部肿瘤、胰腺癌和肺癌等肿瘤中都有表达【_71l。Li等研究显示在肝癌中，CABYRmRNA的水平和蛋白水平都显示在在肝癌组织中比对照癌旁组织表达高，随后采用CABYR的寡核苷酸抑制剂能够抑制肝癌细胞HepG2的细胞周期，增力IG0／G1期，降低S期，证明CABYR在肝癌中发挥一个癌基因的生物学功能【7引。CABYR是与IncRNAoebiotech13222共表达基因之一，那个lncRNAoebiotech13222是否通过CABYR发挥癌基因生物学功能还有待研究证 万方数据博士学位论文第四章实。DCTN5是细胞质动力马达蛋白，与蛋白的泛素化相关173’741。ZNF510是锌子蛋白，Jou研究显示，在舌癌和口腔癌中，证实ZNF510可以作为一个早期的生物标志物17引。从上面与lncRNAoebiotech13222共表达P—value最小的三个基因分析，文献结果显示，这三个基因与肿瘤存在密切的关系，因此，我们推测111cI矾Aoebiotech13222也可能是重症肌无力并发胸腺瘤与重症肌无力无胸腺异常的区别之一，在重症肌无力并发胸腺瘤的过程发挥促进胸腺瘤的作用。上调IncRNAA19P00315959共表达的相关基因的89个基因导入David软件分析。其GO分析结果所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接信号转导、神经系统、认识、G蛋白复合受体蛋白信号、细胞迁移、运动分化等。与lncRNAoebiotech13222共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个负相关基因分别是FMN2、F舢订59A和CD248分子。FMN2是与FMN的同源蛋白，在细胞骨架组织和细胞极性的建立中扮演重要的角色，Yamada等研究发现FMN2参与ARF肿瘤抑制蛋白通路，AIU肿瘤抑制蛋白是INK4d／ARF定位的产物之～，在人类癌症中AKF蛋白经常突变或缺失。癌基因刺激后可上调AKF，它通过与泛素连接酶Mdm2和AKF—BPl／Mule相互作用，细胞应激条件下，核仁ARF与B23相互解离，p53激活。ARF可以与其它许多分子相互作用，是肿瘤治疗的重要靶点【76，771。Yamada等结果显示，ARF作为肿瘤抑制的一个核心组成部分，p14ARF通过结合和抑制HDM2，激活p53，随后，增加转录和表达的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p21随后向细胞周期停止。通过分析p14ARF诱导核内蛋白的动态变化，利用质谱确定FMN2蛋白是p14ARFJ]中瘤抑制途径组分之一。在p14ARF诱导NF．r．B通路时，FMN2在mRNA和蛋白水平都得到增加，并且不依赖-T-p53。FMN2通过抑制其降解而增强细胞周期抑制剂p21的表达，其他致癌基因也会引起FMN2的激活，例如缺氧、DNA损伤等。从而确i正FMN2作为一个重要的调节p21蛋白信号通路的分子之一【7引。FAM59A又名GAREM，是编码调节表皮生长因子受体蛋白受体介导的信号通路，调节蛋白对于生长因子受体的磷酸化发挥至关重要的作用，Tashiro等研究发现GAREM作为表皮生长因子受体的下游Erk／MAPK的重要分子之一，在EGF因子刺激后，GAREM在105位和453位的酪氨酸磷酸化，磷酸化的GAREM对是他与Grb2结合的必要步骤f791。453位氨基端周围的序列和环境与免疫抑制剂Shp2非常相似，Shp2具有GAREM磷酸化的结合ERK的正向调节的方式。从而证实G—6眦M在RGF配体受体介导的信号通路中发挥重要的作用。CD248也认为是肿瘤内皮标志物之一，具有一个C端凝集素domain，含有细胞表面糖蛋白结构，研究显示缺失了CD248功能的老鼠肿瘤生长和炎症反应【80】。综上所述，因此我们推测上调的lncRNAoebiotech13222共表达的FMN2、FAM59A和CD248分子是负相关性，从而导致这三个基因的下调，从而导致肿瘤的产生。112 万方数据博士学位论文第四章下调lncRNAoebiotech22652共表达的相关基因的361个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4—9所示，其GO相关的功能在细胞表面受体链接信号转导、调节RNA代谢、调节转录、DNA结合、免疫反应、防疫反应细胞内在信号、调节增殖、细胞死亡、炎症反应、细胞程序化死亡等。Pathway主要集中细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、NOD．1ike搜提信号、Toll．1ike信号通路、p53信号通路、补体信号通路等。与IncRNAoebiotech22652共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个相关基因分别是PTGS2、CXCLl、CCL3L3。PTGS2又名COX．2，前列腺素内过氧化物合成酶，是前列腺素的生物合成、加双氧酶和过氧化物酶关键酶。有两种同工酶的，它有不同的规定和组织分布的表达式，负责参与炎症的前列腺素类生物合成和有丝分裂发生，在乳腺癌等癌肿发挥作用重要的促进肿瘤生长的作用，Jana等研究显示，发现COX．2在乳腺癌中高表达，且与更年期状态、肿瘤大小、级临床级别、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、Her2基因相关【811。CXCLl属于趋化因子受体家族成员之一，编码的蛋白是一种分泌生长因子信号的G蛋白耦合受体，他们的异常表达与肿瘤密切相关博引。最近提出非可控炎症反应参与肿瘤的发生和发展，Kuo等提出炎症CXCLl／GRO信号通路能够促进前列腺癌细胞的增殖，通过AKT激活NF．kB的磷酸化，从而导致组蛋白去乙酰化导致基因的沉默。而通过抑铜Jfibulin．1D启动子区域的组蛋白的H3、H4的乙酰化而抑制其表达，从而证明CXCLl／GRO介导的AKT／NF．kB信号通路促进前列腺癌的发生发展【831。CCL3L3属于17号染色体细胞因子家族成员之一，该蛋白能够与许多细胞因子受体和趋化因子受体结合【8训，也有研究显示CCL3L3与HIV的易感性相关。而Hwang等通过基因芯片帅选出差异的趋化因子子家族CCL2，CCL3，CCL3L3，CXCLl，通过网络分析他们与TGF[3信号通路相关，而大豆发酵中富含CCL3L3对乳腺癌有预防作用哺5|。lncRNAoebiotech16223共表达的相关基因的296个基因导入David软件分析。其GO分析结果如表4．11所示，其GO相关的功能在免疫反应、防疫反应、调节细胞增殖、细胞死亡、凋亡、炎症反应、程序化死亡等。主要pathway有细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、NOD．1ike受体信号、Toll．1ike信号通路、p53信号通路、凋亡、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等。与lncRNAoebiotech16223共表达的基因相关性靠前且P．value最小的三个相关基因分别是CCL3、SOD2、SERPINB2。其中CCL3代表小的细胞诱导因子，如前面的论述一样，编码的蛋白也称之为也称为巨噬细胞炎性蛋白10【，在与CCRl，CCR4、CCR5等受体结合的免疫反应中扮演重要的角色，这个区域位点的基因多态性存在HIV感染的风附洲。SOD2基因是一个成员的铁／锰超氧化物歧化酶的家庭。它编码一个线粒体蛋白质组成一个同源四聚体，且能够与一个锰离子结合。能够结合到113 万方数据博士学位论文第四章超氧化物的并使之磷酸化，并将它们转换成过氧化氢和双原氧。在这个基因的突变有关与特发性心肌病(IDC)，过早衰老，运动神经元疾病以及癌症相关【86，87，船】。SERPINB2又称为PAl2蛋白，是丝氨酸蛋白酶抑制剂，Jin等认为SERPINB2与肝癌的侵袭与转移呈负相关【89】。Hal卸止ova等研究结果显示高表达的PAl2的治疗效果较差【90J。在重症肌无力胸腺瘤与无胸腺异常组的GO整体分析中，从表面上我们没有直接发现与肿瘤相关的GO和pathway，但是其差异的IncRNA共表达基因很大部分是趋化因子以及细胞因子受体之间相互作用的关系，因此我们推测，在重症肌无力并发胸腺瘤的过程中，显示有有趋化因子和细胞因子之间的相互作用，在慢慢改变其对其他基因的表达调控，从而诱导重症中胸腺瘤的发生和发展。重症肌无力共同差异变化lncRNA与mRNA我们将重症肌无力不分有无胸腺异常(MGl．8)与正常对照组比较，我们发现了139个上调的lncRNA，下调差异lncRNA分子为439个。同时我们将重症肌无力分为胸腺瘤组和胸腺无异常组共同取差异，得到42个共同上调的差异lncRNA分子，92个共同下调的lncRNA分子，同时我们发现这42个上调的lncRNA存在是整体差异139个之中，92个共同下调的lncRNA分子存在于整体下调的439个lncRNA分子中。在共同差异的上调IncRNA中，差异倍数排名前十的lncRNA中，其中有oebiotech11933、A24P927716、oebiotech03926、oebiotech11658、oebiotech13550、A21P0014771等6个相同，其中下调差异倍数排名前十的IncRNA分子，其中oebiotech02627、oebiotech22482、oebiotech09779等3个分子。其中上调的oebiotech11933、A24P927716、oebiotech03926和下调的oebiotech02627、oebiotech22482在前面已经阐述了。通过分析显示这些lncRNA与重症肌无力都相关。lnc砌她的cis分析顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式’’(cis)[91,92】；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”(trans)[93】。顺式作用元件(cis．actingfactor)是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。启动子通常位于转录起始点上游．30—．110bp区域，真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件含7-20bp的DNA序列。最具典型意义的就是TATA盒，它的共有序列是TATAAAA。TATA盒通常位于转录起始点上游．25～．30bp，控制转录起始的准确性及频率。除TA，IA盒外，114 万方数据博士学位论文第四章GC盒(GGGCGG)和CAAT盒(GCCAAT)也是很多基因常见的。增强子远离转录起始点大约1～30kb、决定基因的时间、空间特异性表达。增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。增强子序列可在增强子、也可在启动子中出现。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。有时，对结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。沉默子是某些基因含有的一种负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。这三种顺式作用元件都与基因邻近的序列有关，而lncRNA主要的生物学功能也是参与基因的调控，因此，我们分析差异IncRNA在染色体基因组上的位置，结合lncRNA共表达的基因，分析差异lncRNA可能通过cis的作用调控邻近基因的表达。在重症肌无力并发胸腺瘤组中，我们发现17个lncRNA存在cis调控，在重症肌无力无胸腺异常的差异IncRNA中，发现6个lncRNA存在cis调控的可能，这差异的IncRNA在同一条染色体100kb范围内都存在一个以上的共表达基因，这些可能存在的cis调控是否在重症肌无力中真正发挥生物学功能还需要下一步的研究确证。而在本论文中，我们通过生物信息学的分析，结果IncRNA芯片和共表达的mRNA芯片结果，缩小lncRNA可能在cis调控上的基因的范围，为后面的研究减少了工作量，并且为以后的研究提供实验依据和基础。lnc对悄的trans分析反式作用因子(trans．actingfactor)起反式作用的调控元件【94，95J。是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。有时也称转录因子。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另～基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称反式作用因子。参与基因表达调控的因子，它们与特异的靶基因的顺式元件结合起作用。编码反式作用因子的基因与被反式作用因子调控的靶序列(基因)不在同一染色体上。反式作用因子有两个重要的功能结构域：DNA结合结构域和转录活化结构域，它们是其发挥转录调控功能的必需结构，此外还包含有连接区。反式作用因子可被诱导合成，其活性也受多种因素的调节【96J。在本论文中，我们首先采用共表达差异基因的计算LncRNAs共表达的编码基因集合与转录因子／染色质调控复合物的靶基因集合的交集。从而识别可能与lncRNAs联合发挥调控作用的转录因子／染色质调控因子。在重症肌无力并发胸腺瘤中和重症肌无力胸腺无异常组组中都发现CTCF、MYC和TAFl转录因子存在可能调控差异的lncRNA的表达。CTCF是BORIS+CTCF基因家族成员，编码含有11个锌指蛋白结构域的转录分子。这个核蛋白转录因子能够结合不同的锌指结构域并且能与DNA上不同靶基因序列的启动子115 万方数据博士学位论文第四章区域结合。有文献研究显示，该蛋白能够结合组蛋白乙酰化转移酶复合物作为一个转录激活子，同时也可以结合组蛋白去乙酰化转移酶复合物作为一个转录抑制剂197，98】。Shih等发现CTCF转录因子T和B淋巴细胞在Ag受体的重排中发挥重要的作用，CCCTC结合位点往往合同并形成多个循环，缩短之间的距离，促进基因片段重组事件，CCCTC．binding因子，CTCF成为一个重要的染色质组织和转录监管机构已获得了高度的关注【98】。在我们lncRNA芯片的转录因子中，我们发现CTCF转录因子最为活跃，出现的次数最多，且Shih等研究发现与T和B细胞的Ag受体的重排有关，而重症肌无力恰巧与T和B细胞的分化密切相关。那我们是否可以假想，在CTCF转录因子作用下，调控一部分差异lncRNA的表达，而差异lncRNA调控靶基因的表达，从而参与T和B细胞的重排，从而导致重症肌无力的发生和发展。MYC基因是较早发现的一组癌基因，包括C．myc，N．myc，L—myc，分别定位于8号染色体，2号染色体和1号染色体。结构上由不编码蛋白质的第1外显子和编码蛋白质的第2，3外显子构成。MYC基因属于编码核蛋白的癌基因，3个基因都编码一种与细胞周期调控有关的核内DNA结合蛋白【删。MYC基因家族及其产物可促进细胞增殖，永生化，去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位【l删。MYC基因家族中的3个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。目前认为，C．MYC的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N．MYC的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L．MYC扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。近年来的研究表明是重要的癌基因，同时也是重要的转录因子在调控靶基因的表达发挥重要的作用。他的突变，超表达、重排和易位涉及多种造血肿瘤、白血病、淋巴瘤等多种癌症【101，1021。在重症肌无力并发胸腺瘤中，那么MYC在其中是扮演癌基因的角色还是核转录因子的角色还有待研究。116 万方数据博士学位论文第五章结论：1．2．3．第五章结论通过lncRNA芯片分析发现了重症肌无力并发胸腺瘤患者组和重症肌无力胸腺无异常组及健康对照组的差异表达的lncRNAs和mRNA。通过分析三组部分差异lncRNA的cis和TF调控关系，确定了lncRNA在染色体上的调控关系。通过trans作用机制分析，构建了CTCF—lncRNAoebiotech22642一SMCR7L等三元互相调控网络。 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万方数据博士学位论文综述LncRNA的生物学功能及在神经系统疾病中的作用摘要：本文综述了LongnoncodingRNA(LncRNA)不同的空间结构，进一步总结了IncRNA在表观遗传学、转录水平以及转录后水平水平上对基因表达起调控作用，最后对IncRNA在神经系统疾病中的作用进行了总结归纳，为lncRNA的基础研究以及在神经系统疾病中的研究提供了指导作用。关键词：LongnoncodingRNA，空间结构，基因转录、基因表达调控，免疫性疾病一’biologica’functionsofLncRNAandth,roleinlheDiolol三icallUnctlonSOILncmerole则neurologicaldiseasesInthisarticlewewillintroducethedifferencespatialstructureofthelncRNA，furthermore，weelaboratethefunctionoflncRNAregulationthegeneintheepigeneticstyle，inthetranscription，aswellasmthe一●一r，●，post-transcriptionalcontrol，andfinallywesummarizetheroleoflncRNAinneurologicaldiseases．ThisarticlewillprovidethesomeguidanceforthelncRNAbasicresearchandtheneurologicaldiseases．Keywords：LongnoncodingIⅢA，spatialstructure，genetranscription，geneexpressionregulation，neurologicaldisease．LongnoncodingRNA(简称LncRNA)是一类长度大于200nt,且不表现任何蛋白质编码潜能的RNAs，具有特定的二级结构，在表达上具有组织特异性和时空特异性。与mRNA相比，其序列长度及剪切形式诸多相似，有一些lncRNAs也具有5’帽及多聚腺苷酸尾，其稳定性较好，也还有一些lncRNAs不具有多聚腺苷酸尾【l】，但其序列保守性较差，易受进化压力影响：与microRNAs相比，lncRNAs序列更长、空间结构更复杂【2】。因此，其信息含量更加丰富，参与表达调控的分子机制也更加多样。1．LncRNAs的结构根据lncRNA在基因组上的位置，可将其分为5种类型：1．正义，2．反义，3．双向，4．基因内，5．基因间。目前，LncRNAs的结构研究绝大部分停留在一级及二级127 万方数据博士学位论文综述结构，一级结构的作用主要体现在序列特异性识别、RISC复合物的定位及蛋白结合的调节，小部分体现在siRNA介导的基因干扰及miRNA介导的基因沉默【3J；二级结构主要体现在特异性与核转换系统中的转录终止调控14]；对于更复杂的三级空间结构，目前只能通过已知的其他RNA)JI以揣测。有研究报道推测三级结构可能与变构效应相关，即“诱导．适应”及“构象选择”【5J。四级结构的分子之间交流目前尚未见研究报道。因此，进一步探究IncRNA的空间结构将有助于加深对其在疾病发生发展中的作用认识。2．LncRNA参与基因调控的作用方式目前lncRNAs是非编码RNA最大的组成部分，且随着研究的深入，陆续有新的lncRNAs被发现。多个数据库显示，人类的IncRNA达2万多种，且广泛分布于基因组中，包括有转录起始区域、基因间区域、mRNA的3’端或反式转录本中。然而，IncRNAs的研究尚处于初步阶段，已经鉴定了功能的lncRNAs仅100余种。从已知功能的lncRNAs报道显示，LncRNA的调控作用方式涉及多种途径、多个水平，包括对邻近基因的调控【6】及对区间基因的远程调控I71，既有顺式调控18】，也有反式调控【9】：其作用方式包括：(1)与编码基因启动子区结合，调节邻近蛋白编码基因的表达；(2)介导组蛋白修饰、染色质重构，影响基因表达；(3)与编码基因的转录本形成互补双链，介导mRNA亚型的选择性剪切，或产生内源性的siRNA，参与影响基因的表达；(4)作为小分子RNA(!tlmiRNA、piRNA、mascRNA)的前体分子，参与基因调控；(5)通过直接与相关蛋白质的特异性结合、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体或调节蛋白的亚细胞定位，进一步调节转录或调控蛋白活性【loj。从生物学功能来说，IncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控。2．1LncRNA在表观遗传水平的调控LncRNA表观遗传水平调控涵盖DNA甲基化、染色质重构、组蛋白修饰等多个方面【l¨，其中最为典型的是基因组印记与剂量补偿效应。基因印记的建立与维持发生在生殖细胞的印记控制区(IGF)，主要由DNA甲基化介掣12】。目前明确与基因组印记有关的lncRNA有Air及Kcnqlotl，二者均通过招募组蛋白特异性甲基转移酶，犹如“外套”般包裹特定区域一17号染色体近端的IGF2受体(Igf2r)区和7号染色体远端的Kcnql区，使相应的父源染色体印记基因沉默【13】。LncRNA对组蛋白的修饰模式，除甲基化与去甲基化外，还有乙酰化与去乙酰化、泛素化等多种方式。lncRNAs的另一种表观遗传主要调控形式为剂量补偿效应。RepA为一种长约1．6kb的IncRNA，通过招募PRC2，激活Xist基因座的转录，对于诱导X．染色体失活发挥关键作用。Xist仅转录于被失活的雌性哺乳动物中的一条X染色128 万方数据博士学位论文综述体上，转录后就一直与该染色体保持接触，通过选择性大量募集PRC2，占据染色质上关键位点，并使组蛋白H3K27广泛三甲基化，导致X染色体发生重构而失活【14’”J。而且，另一种IncRNA：Xist的反义转录产物—．TsiX，对于Xist起竞争性抑制作用，能阻止RepA招募PRC2，通过与Xist形成内源性siRNA而抑制Xist的表达【14J。2．2LncRNA参与转录调控水平的调控LncRNA在转录水平的调控包括以下几方面：(1)自身转录时干扰临近基因的表达，如酵母Ser3调控基因l(Sr91)转录时，占据下游的Ser3启动子与RNAPII结合的空间，影响Ser3转录ll6J；(2)作为共因子调节转录因子活性，如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(CDlC在AD患者及正常对照组中表现出明显差异性，可能与局部皮层的白质量相关126]。与突触可塑性相关的lncRNA：BC200在AD患者脑组织中存在明显变化，一项研究发现其在AD患者额叶皮质中的量明显上升，并且上升的程度与疾病严重度相关【271，但另一项研究则显示AD患者中BC200RNA较正常组有70％T斛28J，鉴于IncRNA的组织与时期特异性，截然相反的结果可能与研究对象取材部位不同以及疾病的不同时期有关。这些lncRNAs分别与氧化应激、丝氨酸．苏氨酸激酶、线粒体D．氧化、过氧化物酶、锌指蛋白、组蛋白修饰、高迁移率组20A、蛋白激酶、等AD的易感基因相关，通过参与相应信号传导过程，影响神经系统功能。3．2LneRNA与多发性硬化关系多发性硬化(Multiplesclerosis，MS)是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，发病机制迄今不明，考虑与病毒感染与自身免疫反应、遗传因素及环境因素均有关。近年来有研究提出，其发病与异常活化的CD8+T细胞密切相关。而IncRNA参与了CD8+T细胞的分化及激活过程。相关研究表明，鼠TEA启动子转录的lncRNA参与调节了调控T细胞分化的下游靶基因【291。而在人体内，IL2RA的基因转录的IncRNA，可能与MS易感性相关。由细胞因子基因簇转录的hlcRNA——Z切P哪J已被证实在鼠Theiler脑脊髓炎病毒(TMEV)的持续性感染中起重要作用，而TMEV感染正是因其典型的慢性炎症性脱髓鞘、树突凋亡及轴索变性而成为MS研究的实验模型之一【30】。以上一系列证据都证明了130 万方数据博士学位论文综述IncRNA在相当大的程度上参与了多发性硬化的免疫反应。3．3LncRNA与亨廷顿病的关系亨廷顿病(Huntington’Sdisease，HD)，又称大舞蹈病或亨廷顿舞蹈症(Huntington’Schorea)，是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病。其特征性病理改变为第四对染色体上Huntington基因中CAG三核苷酸重复序列过度扩张，产生大量变异亨廷顿蛋白，在细胞内逐渐积聚，亨廷顿蛋白通过调节转录抑制因子REST的迁移，导致REST靶基因过度表达，引起舞蹈样症状、认知障碍甚至痴呆13¨。一项针对HD患者脑组织lncRNA表达谱的研究表明，患者纹状体hlcRNA：乩堰1F明显下降，导致HARl基因异常表达，出现异常的REST核浆交换[32,33]。而另一种IncRNA：HTT基因的反义转录产物HTTASvl在HD患者额叶皮质中低表达，与内源性HTT转录产物水平增高有关，参与THD的发病过程【341。在HD患者脑组织中出现显著改变的lncRNA还有DGCR5、NEATl、TUGl等，尽管其在疾病发病机制中的角色尚不明确【35J。3．4LncRNA与其他神经系统疾病的关系研究证明，lncRNAs在诸多层面参与神经系统疾病的发生发展，广泛参与包括脑发育、神经元分化及功能保持、神经细胞凋亡等过程。LncI矾A：SOX20T及1810014801Rik在神经变性疾病早期和晚期中都存在明显变化，可能成为潜在的生物标志物，为该类疾病的诊断提供新思路【36J。LncRNA：naPINKl通过巩固其靶基因的正义转录产物svPINKl的稳定性，干扰正常线粒体呼吸链功能，提高细胞对凋亡信号的敏感性，参与帕金森病的发病进程眵7。。MEG3为脑膜瘤中潜在的肿瘤抑制RNA，其印记基因定位于14q32，脑膜瘤患者缺乏MEG3表达，编码的IncRNA与靶基因启动子甲基化程度有关【3引。体外研究显示：脑膜瘤患者MEG3启动子与印记控制区CpG甲基化频率与肿瘤的侵袭生长进程密切相关，而去甲基剂5硫唑嘌呤2脱氧胞苷能促进MEG3重表达，均提示该编码lncRNA可能成为潜在的脑膜瘤治疗新靶点【驯。4．总结与展望继miRNA之后，IncRNA近年来逐渐成为研究的一大热点。与编码蛋白的mRNA相比，多数IncRNA表达谱的组织特异性使其作为疾病诊断和预后判断标志物的前景更值得期许【40】。LncRNA涉及多种水平的分子调控，在肿瘤、变性疾病及免疫性疾病方面都发挥重要的作用，如人MATAT-1在肝癌组织中的高表达、PCA3与前列腺肿瘤的分化分期相关【4¨，以及肝癌患者血清中高表达的HULC，都是IncRNA分子有诊断应用前景的证明。除此之外，作为相应疾病治疗的新靶点，其可塑性也值得期许，有待进行更加深入的研究。如研究人员发现，当干扰IncRNANRON后，NFAT的活性增加，其机理为NRON与NFAT转入细胞核的13l 万方数据博士学位论文综述importin．B家族蛋白成员结合。这提示可针对NFAT异常引起的疾病进行NRON的诊治探索。针对lncRNABACElAS的siRNA实验，使得阿尔茨海默模型中的p淀粉样蛋白累积减少，可能成为延缓该病进程的治疗药物潜在靶点。针对某些IncRNA作用的专一性，可针对性设计治疗性药物，尽量降低对其他无关基因的影响，以达到个性化治疗的目的。但由于lncRNA本身的特殊性，如种类繁多、原始序列所包含的信息少及研究手段的限制，对其调控机制的认识仍较肤浅，同时，lncRNA与其他调控机制作用时受到体内微环境的影响方面，也有待于继续深入的研究。参考文献【1】．ClarkMB，JohnstonRL，Inostroza·PontaM，eta1．，Genome—wideanalysisoflongnoncodingRNAstability．GenomeRes．2012，22(5)：P．885-98．【2】．QureshiIA，MattickJSMehlerMF，Longnon-codingRNAsinnervoussystemfunctionanddisease．BrainRes．2010，1338：P．20—35．[3]．ZamorePD，AncientpathwaysprogrammedbysmallRNAs．Science．2002，296(5571)：P．1265·9．[4】．BreakerRComplexriboswitches．Science．2008，319(5871)：P．1795-7．[5】．VaianaACSanbonmatsuKYStochasticgminganddrug-ribosomeinteractions．JMolBi01．2009，386(3)：P．648—61．[6】．TufarelliC，StanleyJA，GarrickD，eta1．，TranscriptionofantisenseRNAleadingtogenesilencingandmethylationasanovelcauseofhumangeneticdisease．NatGenet．2003，34(2)：P．157—65．【7】．KhalilAM，GuttrnanM，HuarteM，eta1．，ManyhumanlargeintergenicnoncodingRNAsassociatewithchromatin-modifyingcomplexesandaffectgeneexpression．ProcNatlAcadSciUSA．2009．106(28)：P．11667-72．【8】．WangX，AraiS，SongX，eta1．，InducedncRNAsallostericallymodifyRNA-bindingproteinsincistoinhibittranscription．Nature．2008，454(7200)：P．126．30．[9】．RinnJL，KerteszM，WangJK，eta1．，FunctionaldemarcationofactiveandsilentchromatindomainsinhumanHOXlocibynoncodingRNAs．Cell．2007，129(7)：P．1311-23．【10]．KhalilAMRinnJL，RNA—proteininteractionsinhumanhealthanddisease．SeminCellDevBi01．2011，22(4)：P．359—65．132 万方数据博士学位论文综述【11】．KurokawaRRosenfeldMGGlassCK，TranscriptionalregulationthroughnoncodingRNAsandepigeneticmodifications．RNABi01．2009，6(3)：P．233—6．【12]．NaganoT，MitchellJA，SanzLA，eta1．，TheAirnoncodingRNAepigeneticallysilencestranscriptionbytargetingG9atochromatin．Science．2008，322(5908)：P．1717．20．[13]．BarlowD只Genomicimprinting：amammalianepigeneticdiscoverymodel．mllnuRevGenet．2011，45：P．379-403．[14]．YildirimE，KirbyJE，BrownDE，eta1．，XistRNAisapotentsuppressorofhematologiccancerinmice．Cell．2013，152(4)：P．727·42．[15]．FrobergJE，YangLLeeJT，GuidedbyRNAs：X-InactivationasaModelforIncRNAFunction．JMolBi01．2013，425(19)：P．3698—706．【16]．SaxenaACaminciP，Longnon-codingRNAmodifieschromatin：epigeneticsilencingbylongnon-codingRNAs．Bioessays．2011，33(11)：P．830-9．[17]．CesanaM，CacchiarelliD，LegniniI，eta1．，AlongnoncodingRNAcontrolsmuscledifferentiationbyfunctioningasacompetingendogenousRNA．Cell．2011，147(2)：P．358—69．【18]．KotakeYNakagawaT’KitagawaK，eta1．，Longnon-codingRNAANRILisrequiredforthePRC2recruitmenttoandsilencingofpl5(INK4B)tuiTIorsuppressorgene．Oncogene．2011，30(16)：P．1956-62．[19]．GuptaRA，ShahN，WangKC，eta1．，Longnon—codingRNAHOTAIRreprogramschromatinstatetopromotecancermetastasis．Nature．2010，464(7291)：P．1071—6．[20]．NieL，WuHJ，HsuJM，eta1．，Longnon-codingRNAs：versatilemasterregulatorsofgeneexpressionandcrucialplayersincancer．AmJTranslRes．2012，4(2)：P．127-50．[21]．TushirJSAkbarianS，Chromatin-boundRNAandtheneurobiologyofpsychiatricdisease．Neuroscience．2013．【22]．ParentiRParatoreS，TorrisiA，eta1．，AnaturalantisensetranscriptagainstRadl8，specificallyexpressedinneuronsandupregulatedduringbeta-amyloid-inducedapoptosis．EurJNeurosci．2007，26(9)：P．2444·57．[23]．FaghihiMA，ZhangM，HuangJ，eta1．，Evidencefornaturalantisensetranscript-mediatedinhibitionofmicroRNAfunction．GenomeBi01．2010，11(5)：P．R56．’[24】．FaghihiM气ModarresiF，KhalilAM，eta1．，ExpressionofanoncodingRNAis133 万方数据博士学位论文综述elevatedinAlzheimer’Sdiseaseanddrivesrapidfeed-forwardregulationofbeta-secretase．NatMed．2008，14(7)：P．723-30．【25】．MassoneS，VassalloI，FiorinoGeta1．，17A，anovelnon-codingRNA，regulatesGABABalternativesplicingandsignalinginresponsetoinflammatorystimuliandinAlzheimerdisease。NeurobiolDis．2011，41(2)：P。308·17．【26]．ChenGQiuc，ZhangQ，eta1．，Genome—wideanalysisofhumanSNPsatlongintergenicnoncodingRNAs．HumMutat．2013，34(2)：P．338-44．【27]．MusE，HofPRTiedgeH，DendriticBC200RNAinagingandinAlzheimer’Sdisease．ProcNatlAcadSciUSA．2007，104(25)：P．10679-84．[281．LukiwWJ，HandleyP，WongL，eta1．，BC200RNAinnormalhumanneocortex，non-Alzheimerdementia(NAD)，andseniledementiaoftheAlzheimertype(AD)．NeurochemRes．I992，17(6)：P．591-7．【29]．PangKC，DingerME，MercerTReta1．，Genome-wideidentificationoflongnoncodingRNAsinCD8+Tcells。JImmun01．2009，182(12)：P。7738—48．[301．CollierSP，CollinsPL，WilliamsCL，eta1．，Cuttingedge：influenceofTmevpgl，alongintergenicnoncodingRNA，ontheexpressionofIfngbyThlcells．JImmunol。2012，189(5)：P．2084—8。[31]．ZuccatoC，TartariM，CrottiA，eta1．，Huntingtininteracts谢tllREST／NRSFtomodulatethetranscriptionofNRSE—controlledneuronalgenes．NatGenet．2003，35(1)：P．76-83．[32]．JohnsonRRichterN，JauchReta1．，TheHumanAcceleratedRegion1noncodingRNAisrepressedbyRESTinHuntington’Sdisease．PhysiolGenomics．2010．【33]．SeongIS，WodaJM，SongJJ，eta1．，Huntingtinfacilitatespolycombrepressivecomplex2．HumMolGenet．2010，19(4)：P．573—83．【34]．ChungDW，RudnickiDD，YuL，eta1．，AnaturalantisensetranscriptattheHuntington’SdiseaserepeatlocusregulatesHTTexpression．HumMolGenet．201l，20(17)：P．3467-77．【35]．JohnsonRLongnon-codingRNAsinHuntington’Sdiseaseneurodegeneration．NeurobiolDis．2012，46(2)：P．245-54．【36]．ArisiI，D’OnofrioM，BrandiReta1．，GeneexpressionbiomarkersinthebrainofamousemodelforAlzheimer’Sdisease：rnjllingofmicroarraydatabylogicclassificationandfeatureselection．JAlzheimersDis．2011，24(4)：P．721-38．[37]．SaiYZouZ，PengK，eta1．，TheParkinson’Sdisease-relatedgenesactin134 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万方数据博士学位论文致谢深深感谢恩师肖波教授对我学习、工作和生活的谆谆教诲!恩师高尚的医德、渊博的学识、精湛的医术、严谨求实的工作态度、精益求精的科学精神，在学习期间对我影响巨大，恩师的言传身教使我终身受益!衷心感谢杨欢教授对我在临床、科研工作中精心指导和生活上的亲切关怀。杨老师以身作则，教导我们严谨的治学态度和认真负责的做事风格，这些将会让我终生受益。衷心感谢罗朝辉老师对我学习和课题的指导支持!衷心感谢杨期东教授、杨晓苏教授、刘运海教授、李国良教授、杜小平教授、田发发教授、许宏伟教授、严新翔教授、周文斌教授、杨杰教授、肖岚副教授、龙小艳副教授、李蜀渝副教授、谷文萍副教授、李曼副教授、张宁副教授、刘卫平副教授、李静副教授、沈璐副教授、夏健副教授、张乐副教授、周琳副教授、贺建安主治、叶晖主治、毕方方主治、黄清主治、郭纪峰主治、冯莉医师、陈锶医师、李艺医师、唐薇婷医师、王峻岭医师、姜海燕老师、梁静慧老师、吴志国老师，徐立群老师以及所有神经内科老师在临床和科研上的无私指导和帮助!衷心感谢我的师兄姐、师弟妹张勇博士、张忱博士、刘鼎博士、易芳博士、胡崇宇博士、姜婷博士、秦冰博士、胡凯博士、唐海云博士、刘扬博士、吴倩博士、尹炜凡博士、解媛媛博士、王美萍博士、向田博士、詹琼博士、罗梦川博士、王未飞硕士、周嫔婷硕士、刘楚娟硕士、王明月硕士、李爱平硕士、方红军硕士、黎思茹硕士等在临床和实验上的帮助和多年来的珍贵友情!衷心感谢中南大学肿瘤研究所的所有老师和同学，为我提供了宝贵的指导和建议，使实验能够顺利开展和完成!深深感谢我的父母，他们多年来的默默支持、无私奉献是我最坚强的后盾，他们的无私奉献为我解除了后顾之忧，使我能够顺利完成学业。感谢他们默默无闻、无怨无悔地陪我走过艰辛而漫长的求学之路。衷心感谢关心与支持我的师长、朋友、同事和家人，感谢所有给予我帮助的人!我将终生铭记于心、并不断敦促自己、努力奋斗，开创一番成绩，回报所有人对我的关心、指引与帮助1137