内质网应激相关蛋白调控心肌细胞mmps的研究

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1、硕士学位论文内质网应激相关蛋白调控心肌细胞MMPs的研究题目TheStudyofEndoplasmicReticulumStressRelated英文题目ProteinsonAdjustingMMPsinTheMyocardialCells姓名詹友芹学号10020085所在学院医学院导师姓名吴旻主任医师专业内科学入学日期2010年9月答辩日期2013年5月学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或

2、撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：

3、年月日日期：年月日硕士研究生学位论文内质网应激相关蛋白调控心肌细胞MMPs的研究专业：心血管内科研究生：詹友芹导师：吴旻主任医师指导老师：吴旻主任医师李冠武教授本课题为国家自然科学基金（NO.30700326）汕头大学医学院临床基础医学课题广东省大学生创新实验项目基金（NO.1056010008）资助课题中国汕头2013.5汕头大学医学院硕士学位论文摘要背景内质网应激（Endoplasmicreticulumstress,ERS）是一种因缺血、缺氧等内质网理化环境改变和内质网过负荷等因素触发的高度保

4、守的细胞应激性反应。适度的ERS可通过未折叠蛋白反应(Unfolded-ProteinResponse,UPR)机制恢复细胞自稳态和修复损伤。但持续或过度的ERS通过激活ER相关凋亡途径诱导细胞损伤和凋亡。钙网蛋白（calreticulin,CRT）是内质网主要的钙结合蛋白，具有分子伴侣、调控细胞内钙稳态、蛋白质合成和修饰等多种功能，参与生物体内多种生理和病理过程。细胞发生ERS时，CRT表达升高，可作为ERS标志性分子之一。本课题组前期研究发现CRT影响基质金属蛋白酶（MatrixMetallop

5、roteinases,MMPs）mRNA表达及酶的活性。近年来多项研究表明ERS在心肌缺血再灌注损伤、急性心肌梗死、冠心病不稳定斑块的形成以及心力衰竭的发生、发展等多种心血管疾病中起着重要的作用。ERS导致的相关细胞凋亡所参与的心肌细胞丢失，是影响缺血性心肌病心室重构的重要因素，但关于ERS能否影响细胞外基质成份的调节从而参与心室重构，尚需进一步深入研究。目的本实验第一部分拟用H2O2处理H9C2心肌细胞，诱导ERS，进一步研究MMP-2和MMP-9活性的变化。第二部分利用了钙网蛋白基因敲除小鼠胚胎

6、成纤维细胞（crt-/-）和野生型小鼠胚胎成纤维细胞（wt）为研究对象，探讨CRT基因的缺失对JNK活性的影响及JNK与p53的关系，以进一步揭示ERS相关性蛋白CRT调节细胞外基质成份的分子机制。方法1.不同浓度的H2O2处理H9C2心肌细胞，MTT法检测其对细胞活性的影响，检测CRT、GRP78两种内质网应激性相关蛋白的表达，并收集培养基用明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的酶活性。2.体外培养wt和crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞，提取总蛋白，用JNK特异性抗体从总蛋白中亲和分离出JNK蛋白，

7、加入ATP和JNK特异性底物c-Jun进行细胞外磷酸化反应。用Westernblot检测反应产物中c-Jun的磷酸化水平，以此来反映细胞内JNK的活性。I汕头大学医学院硕士学位论文3.在wt细胞及crt-/-细胞加入不同浓度JNK抑制剂SP600125(0，20，30umol/l)处理24h，检测p53蛋白的表达；并用不同浓度p53抑制剂PFT-α(0，50，80umol/l)作用wt细胞及crt-/-细胞24h，检测JNK蛋白的表达。结果1.MTT结果显示H9C2心肌细胞在H2O2（0~700um

8、ol/l）作用2h，其细胞活性与对照组相比未见明显变化。当H2O2浓度高达1000umol/l时对H9C2细胞活性有显著抑制作用（p＜0.05）。2.与对照组相比，不同浓度H2O2处理H9C2心肌细胞2h并未引起CRT表达的改变。H2O2处理H9C2心肌细胞4h引起CRT表达增高，p＜0.05，并且使其MMP-2活性升高，MMP-9活性下降，但未引起GRP78的改变。3.细胞外测定JNK活性提示wt细胞株c-Jun的磷酸化水平与crt-/-细胞株比较无明显差别。4.给