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1、第30卷第4期水生生物学报Vol.30,No.42006年7月ACTAHYDROBIOLOGICASINICAJuly,2006三种鳖线粒体DNA细胞色素b基因序列的比较分析陈合格刘文彬李建中张轩杰(湖南师范大学生命科学学院,长沙410081)摘要:对中华鳖、砂鳖和山瑞鳖线粒体DNA细胞色素b基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCR-PFLP(Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)分析。研究结果表明中华鳖、砂鳖与山瑞鳖线粒体DNACytb基因的序列全长相同,均为1140
2、bp,其A、C、G、T含量相似,分别为378个(33.2%)、322个(28.2%)、122个(10.7%)、318个(27.9%)、373个(32.7%)、324个(28.4%)、124个(10.9%)、319个(28.0%)、380个(33.3%)、330个(28.9%)、127个(11.1%)、303个(26.7%)。同源性及序列差异率分析表明:中华鳖与砂鳖b基因序列的同源性为92.3%,中华鳖、山瑞鳖的为85.0%,砂鳖、山瑞鳖的为84.1%;中华鳖与砂鳖b基因核苷酸序列间的差异率为7.7%,中华鳖、山瑞鳖间的序列差异率为15.0%,砂鳖、山瑞鳖间的序列差异率为1
3、5.9%,而中华鳖、砂鳖、山瑞鳖各自个体间的序列差异率分别为2.37%、0.88%和0.18%,种间差异显著。用内切酶酶切分析其扩增产物,结果表明:用内切酶Nde可准确鉴别砂鳖,而用内切酶BamH则可准确鉴别山瑞鳖。内切酶Nde和BamH的联用分析,可使这三种鳖在分子水平都得到明确的鉴定。从三种鳖线粒体DNACytb基因核苷酸序列的显著差异和酶切位点的变化,可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。关键词:中华鳖;砂鳖;山瑞鳖;细胞色素b;PCR-RFLP分析;分子鉴定标记中图分类号:Q173文献标识码:A文章编号:1000-3207(2006)04-
4、0380-06中华鳖(Pelodiscussinensis)是中国重要的特种经动物线粒体DNA(mtDNA)呈严格的母性遗传方济动物,其隶属于龟鳖目(Testudinata)、鳖科(Triony-式,这样1个个体就能代表一个母系集团,因而只需[1]chidae)、鳖属(Pelodiscus)。山瑞鳖(Paleastein-少量材料就能反映群体的遗传结构,便于进行群体dachneri)俗称瑞鱼、山瑞,在国家重点保护野生动物分析。随着分子生物学的发展,动物线粒体DNA上名录中被列为国家级保护动物,其一般形态与中的细胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因因其进化
5、速华鳖极为相似,隶属于龟鳖目、鳖科、山瑞鳖属度适中被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度(Palea)。传统观点认为,中国鳖属动物仅有中华鳖的良好指标,近年来被广泛应用于两栖类、爬行类、[35]一种。1991年,周工健等在对湖南省鳖资源进行实鱼类等的系统发育、种类鉴别等的研究。本研地调查时,发现了一种与现有鳖种资料介绍完全不究以中华鳖、砂鳖和山瑞鳖为研究材料,进行了同的新种砂鳖(Pelodiscusaxenaria),又称铁壳、mtDNACytb基因的引物设计、PCR扩增及其序列测灰壳。其与中华鳖体形较相似,但个体较小,体重一定,分析了3种鳖线粒体DNACytb基
6、因核苷酸序列般为100300g,且在外形、骨骼、繁殖习性和生活习间的差异及其酶切位点的差异情况,为确定它们的性,以及生化遗传学指标等方面与中华鳖均存在明种间遗传关系和分子方法分类提供了实验依据,获[2]显的差异,并判定砂鳖为鳖属一新种。如能从分得了3种鳖的分子鉴定标记。子水平进一步予以证实并找到一个准确可靠的鉴别1材料与方法方法来有效区分中华鳖、砂鳖与山瑞鳖,对于这3个不同种鳖的种苗区分、资源保护及合理开发利用具11材料来源中华鳖12只取自湖南省中华鳖原有重要意义。种场,5只购买于新一佳超市;17只野生砂鳖中的7收稿日期:2005-10-29;修订日期:2006
7、-01-14基金项目:农业部中华鳖标准(编号:1999-Q-1603161)项目资助作者简介:陈合格(1979),男,湖南祁阳人,硕士,从事水生动物遗传与育种研究通讯作者:张轩杰,男,教授,博导,Tel:0731-8872552,E-mail:zh603@tom.com4期陈合格等:三种鳖线粒体DNA细胞色素b基因序列的比较分析381只取自常德市,其余10只取自郴州市安仁县永乐脂糖凝胶,5V/cm进行电泳分离约1h,EB染色,然后江;3只野生山瑞鳖全部取自广西省南宁市。用凝胶成像系统扫描并保存结果。在经过PCR-12
