bm-msc诱导移植免疫耐受和修复慢性移植肾损伤的初步研究

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1、中图分类号R656UDC610博士学位论文学校代码!Q533BM．MSC诱导移植免疫耐受和修复慢性移植肾损伤的初步研究PreliminarystudyonbonemarrowmesenchymalstemceUsinducetransplantinlmunetoleranceandrepairofchronicrenalaUograf．tinjuryreDalr0ICnronlCrenaIallograItlnlUrV作者姓名：陈正学科专业：临床医学研究方向：外科学所在学院：湘雅二医院指导教师：齐海智教授答辩委员会主中南大学二O一三年五月博士学位论文

2、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：j望日期：7巫年—厂月业日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩

3、印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：2盟导师签名壶尘’门日期：巫年—[月卫摘要骨髓问充质干细胞诱导移植免疫耐受和修复慢性移植肾损伤的初步研究第一部分骨髓间充质干细胞的分离、纯化、鉴定及体内分布与输注途径的关系目的：探讨骨髓间充质干细胞(BM．MSC)分离、纯化和细胞鉴定的方法和超顺磁氧化铁(SPIO)标记BM．MSC方法的安全性及可行性，分析BM．MSC在体内分布与细胞输注途径的关系，以确定BM．MSC的最佳输注途径。方法：取西藏小型猪骨髓，

4、采用密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞进行分离和纯化，观察其生长曲线。对所获取的细胞进行成脂、成骨诱导分化，并应用流式细胞术检测细胞表面标志物CD45／CD90／CD105，以鉴定所纯化细胞是否为BM．MSC。应用SPIO对BM．MSC进行体外标记，用MTT法检测不同浓度SPIO对标记后细胞活力和增殖能力的影响。建立西藏小型猪同种异体肾移植模型，分别经移植肾动脉和经髂总静脉输注SPIO标记的BM．MSC，切取受体猪各器官，通过普鲁士蓝染色和透射电镜观察标记的BM．MSC在移植肾、肺脏及其他器官的分布情况。结果：应用梯度密度离心法可获取高纯度的BM．MS

5、C，细胞具有良好的生长活力和传代能力。BM．MSC可经诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，应用茜红素和油红0染色可检测出细胞中钙结节和脂TT中文摘要肪颗粒；经流式细胞术检测细胞表面标志物CD90阳性率为96．9％，CDl05阳性率为95．7％，CD45阳性率为1．1％(阴性)。SPl0对BM．MSC的标记率接近loo％，通过MTT法检测25u咖l的SPIO对BM．MSC的增殖能力影响较少、又可有效标记细胞是比较适宜的标记浓度，50u咖l的SPIO标记细胞2天后细胞活性减退。透射电镜可观察到BM．MSC细胞内小囊泡包含的高密度铁粒子。采用供肾动脉与髂总动脉、

6、供肾静脉与髂总静脉端侧吻合的方式成功建立西藏小型猪肾移植模型，将标记的BM．MSC分别经移植肾动脉和髂总静脉输注后，观察BM．MSC在受体猪体内分布显示：经移植肾动脉输注组，BM．MSC在移植肾内定植的细胞数明显多于经髂总静脉输注组，且存在统计学差异；经髂总静脉输注组，肺内的细胞数增加，有统计学差异。两种输注途径均未发生血管栓塞、感染等并发症。结论：采用密度梯度离心法可获取高纯度、生长活力良好的BM．MSC；利用细胞外形特征、诱导定向分化和细胞表面标志物可成功鉴定BM．MSC；应用SPIO标记BM．MSC的方法简便可行，易于细胞在体内示踪；经移植肾动

7、脉输注BM．MSC是安全和理想的输注途径，有利于BM．MSC在移植肾内定植、分化。关键词：骨髓间充质干细胞；分离；鉴定；体内分布第二部分自体BM．MSC诱导亲属活体供肾移植免疫耐受的临床初步研究目的：通过对亲属活体肾移植受者输注白体间充质干细胞联合应用低剂量FK506进行免疫诱导，观察移植术后受者的移植肾功能、淋巴细胞亚群及比例和急性排斥反应发生率等指标，探讨自体骨髓间充质干细胞诱导移植免疫耐受的效果及其作用机制。方法：随机选择2009．9—2012．9在我中心拟行亲属活体供肾移植的慢性肾功能不全(尿毒症期)患者，按照纳入标准入组，分为不输注自体BM

8、—MSC的对照组(10例)和输注自体BM。MSC的实验组(10例)。实验组在术前1月行自体骨髓间充质干细胞制