影响载体构建的关键因素

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1、影响载体构建的关键因素白利利1,2杨慧兰*1樊建勇1（1.广州军区广州总医院皮肤科广东广州5100102.华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006）摘　要:目的为载体构建提供方法参考。方法总结载体构建实验中各个环节的经验教训。结果确立了分子克隆中的关键影响因素。结论实验中小细节是影响实验的关键。关键词:载体构建;注意事项；问题与分析中图法分类号:Q78;R331　　　文献标识码:AKeyfactorsintheconstructionofplasmidBAILi-li1,2,YANGHui-lan*1,FANJian-yong1(1

2、.GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Dermatologyguangdongguangzhou5100102.SouthChinaUniversityofTechnology,BiologicalScienceandEngineeringSchoolguangdongguangzhou510006)基金资助：全军医学科学技术研究“十一五”计划课题项目.课题编号06J008.作者简介：白利利，女，山东泰安人，在读硕士研究生，从事病毒分子生物学研究。电话：(020)3665350

3、8Email:bll-1012@163.com通信作者：*杨慧兰，电话:02036653508.Email:huilany@medmail.com7Abstract:ObjectiveTosupplymethodreferenceforconstructionofplasmid.MethodsSummarytheexperienceinthecomponentofconstruction.ResultsEstablishthekeyfactorsintheplasmidconstruction.ConclusionTinydetailsint

4、heexperientaretheimportantelementstoconstructionoftheplasmid.Keywords:plasmidconstruction;announcements;problemandanalyze载体构建是分子生物学常规实验。其过程无非包括：“扩，切，连，转，筛”五个步骤，虽然简单，但影响因素很多，任一步操作不当都会影响构建结果，现将构建过程中的注意事项分析如下：1目的片段的PCR扩增1.1引物的设计A:引物的长度一般为15bp～30bp,常用的是18bp～27bp，但不应大于38bp.B:引物3

5、’端避免出现3个以上的连续碱基,同时避免在引物的3’端使用碱基AC:引物序列的GC含量一般为40%～60%，上下游引物的GC含量不能相差太大D:引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。E:对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,对目标基因与质粒多克隆位点进行分析，选择目的基因不含的酶切位点，另外在酶切位点的5’端添加2个～3个保护碱基。F:公司合成后的引物序列单一定要检查，有时会出现合成错误的情况。1.2PCR反应条件的优化[1]A:优化PCR反应的基本条件以增加特异性B:加入优化增强剂，如DMSO,PEG-600,甘油，

6、非离子去污剂，甲酰胺，牛血清白蛋白等C:采用热启动技术1.3常见问题及分析A:扩增目的产物条带较弱，或不能检测到相应条带。解决：更换新鲜试剂，换用其他PCR机，重新计算TM值，应用降落PCR，优化MgCl2，模板DNA，dNTP的浓度，增加复性时间或设置更高的复性温度7B:多种扩增产物条带。解决：优化引物的浓度，或重新设计引物C:引物二聚体过量。解决：应用降落PCR,最好结合热启动或加强PCR，或重新设计引物1酶切质粒载体与目的片段2.1酶切体系的优化[1]A:加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响B:两种或

7、两种以上限制酶切割DNA时，选择其通用缓冲液，若没有则可先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，再加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；或使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。C:反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。D:浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。2.2底物性质A:反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，建议酶切反应的DNA浓度为0.1ug/ul-0.4ug/ul.B:酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿

8、、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度。2.3温度条件高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。2.4星型反应