一种脂肪组织来源树突状细胞鉴定及功能的研究

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1、江苏大学硕士学位论文摘要目的：在高脂饮食(hi曲一fatdiet，心D)诱导的肥胖小鼠脂肪组织中，发现一群未成熟的、具有分泌促炎症性细胞因子的树突状细胞，并研究这种脂肪组织来源树突状细胞(adiposetissuedendriticcells，ATDCs)的表型及生物学功能。方法：1．采用FITC抗小鼠CDllc单克隆抗体(mAb)对盯D和正常饮食(nomaldiet，ND)小鼠脂肪组织来源的细胞进行染色；应用免疫磁珠法将ⅢD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CDllc+细胞进行分选，电镜观察其形态，并采用

2、PE—Cy5抗小鼠CD3和B220mAb对细胞染色，通过流式细胞术(flowc”omet拶，FCM)进行分析。2．利用免疫磁珠分选方法将mD小鼠脂肪组织或脾脏组织来源的CDllc+细胞分选，同时分离ND小鼠腹腔巨噬细胞，将分离的三组细胞分别与表达红色荧光蛋白HcRed的大肠埃希菌(经3％多聚甲醛固定)37℃共培养2h，同时设立LPS刺激组，FCM分析各组细胞的吞噬能力。3．应用FITC抗小鼠CDllcmAb及PE抗小鼠CD40、CD80、CD86、MHC．I、MHC．IImAb对HFD和ND小鼠脂肪组

3、织细胞及脾脏组织细胞进行染色；FCM分析HFD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CDllc+细胞的表型。一种脂肪组织来源树突状细胞的鉴定及功能研究4．应用实时荧光定量PCR(Real．timequantitativePolymer懿eChainReaCtion，qI玎-PCR)的方法检测ⅢD小鼠ATDCs及脾脏来源DC(SPDCs)的几-6、TGF—p、IL．23p19、IL一12p40及几一12p35等细胞因子r曲NA的表达水平；酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedInullunosorbentAs

4、say，ELISA)检测ATDCs和SPDCs培养上清中IL一6及IL．23的蛋白表达水平口5．应用免疫磁珠分选方法将ⅫD和ND小鼠脂肪组织中的CD4+T细胞分离，将分离出的CD4+T细胞中加入离子霉素(ionomycin)和乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbolmyristateacetate，PMA)共培养4h，qRT—PCR检测IL一17及RO脚mRNA的表达水平。6．应用免疫磁珠法分别分选6—8w正常小鼠脾脏来源的CD4+T细胞、}玎?D小鼠ATDCs或SPDCs，将1×106的CD4+T细胞和2×

5、105的ATDCs或SPDCs共培养，同时设置抗小鼠IL．6mAb组、抗小鼠IL．23mAb组、抗小鼠IL．6mAb+抗小鼠IL．23mAb组及对照免疫球蛋白组；应用FITC抗小鼠CD4mAb及PE抗小鼠IL．17mAb对不同共培养体系中的细胞进行染色，FCM分析n17细胞的比例，ELISA检测培养上清中IL．17的蛋白水平。7．应用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，RT-PCR)方法检测ATDCs中趋化因子受体CCR6、CCR5及CXCl毪的表达，同时应用qlH．PCR

6、的方法检测耶D及ND小鼠脂肪组织中相应趋化因子CCL20、MIP．1及IL．8的表达水平。江苏大学硕士学位论文结果：1．FCM检测发现，与ND小鼠相比，耶D小鼠脂肪组织中CDllc+细胞的比例明显增高；脂肪组织中CDllc+细胞具有很长的突触，富含线粒体并且胞质中极少看到溶酶体；同时脂肪组织来源的CDllc+细胞均不表达CD3及B220分子；吞噬实验结果显示脂肪组织来源的CDllc+细胞的吞噬能力强于CDllC+SPDCs，但又低于腹腔巨噬细胞；而脂肪组织来源的CDllc+细胞的F4／80分子的表达与

7、CDl1c+SPDCs相近，但低于腹腔巨噬细胞。上述结果提示心D小鼠脂肪组织中存在着一群形态典型的CDl1c协Cs；与ND小鼠相比较，ⅢD小鼠脂肪组织中浸润的CDl1c+DCs细胞的比例明显增高。2．FCM结果显示ATDCs的表面分子MHCI及MHCII，共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达均低于SPDCs；LPS刺激后，ATDCs的MHC分子或共刺激分子的表达均未有明显变化，并且ATDCs吞噬功也未发生改变，表明脏D小鼠脂肪组织的ATDCs是一群未成熟的、表型稳定的DC。3．qRT—PCR检

8、测显示，与SPDCs相比，ATDCs促炎症性细胞因子IL一6mRNA(8．103士1．067wl11．5士24．39，∥O．01)、TGF-pmRNA(15．44士1．641w43．6l士5．417，p