用于nmr结构的研究shp-2蛋白n端sh2结构域原核制备及同位素标记

《用于nmr结构的研究shp-2蛋白n端sh2结构域原核制备及同位素标记》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、浙江理工大学硕士学位论文用于NMR结构研究的SHP．2蛋白N端SH2结构域的原核制备及同位素标记摘要Src-homologyregion2(SH2)结构域作为一种结构模组在后生动物信号转导相关蛋白中广泛存在。SH2结构域由约100个氨基酸构成，它能够与含有磷酸化酪氨酸残基(pY)的多肽特异结合。对SH2和相应特异底物结合复合体的晶体结构研究揭示出这种特异性取决于磷酸化的酪氨酸残基后面的5个氨基酸残基。这种结合特异性是很多信号转导通路的基础，对这些信号通路是非常重要的。因此，SH2结构域已经成为了开发

2、新药物的针对目标。SrcHomologyRegion2-ContainingProteinTyrosinePhosphatase2(SHP-2)，在N端含两个SH2结构域(NSH2和CSH2)，C端含有一个磷酸酶结构域(PTP)。SHP．2被发现在很多信号通路中发挥作用，如生长因子PDGF、EGF和IGF．1，细胞因子IL一3、GM．CSF和EPO以及胰岛素、干扰素等诱发的信号转导通路。这些信号通路对调控细胞生长和分化起着关键的作用。晶体结构学研究表明SHP．2的磷酸酶活性的激活，是由其自身的SH2

3、结构域完成的。当特异的pY多肽与其NSH2结构域结合后，NSH2结构域解除对其PTP结构域的活性抑制。然而，对SHP一2的发病机制所了解还比较少。NSH2作为SHP．2蛋白自调控的关键结构，能与多种特异的pY多肽结合，引发不同的细胞内信号级联放大，调控细胞的生命活动或者引发细胞病变。研究NSH2与其底物的作用机理能够帮助人们寻找到治疗相关机病的药物和方法。结构研究是揭示这一机理的重要手段，晶体结构学方法已经很成熟，而新兴的核磁共振(NMR)结构研究方法比晶体结构研究更能反映出天然结构状态。而且能反映

4、出发生分子相互作用时结构的变化，因为NMR是解析溶液中蛋白的方法，溶液环境更接近天然环境，而且溶液中容易进行分子相互作用。但是M订R对蛋白质溶液的纯度、浓度和稳定性要求较高。我们的研究报道一种从载体设计构建到蛋白表达纯化和浓缩的高效方案。这种方案得到的蛋白能够用于NMR结构研究，当然，也能应用于其它方面，如功能研究等。我们设计得到的表达载体能够进行高效率表达，我们从1L表达菌中纯化出了约12mg高纯度的NSH2蛋白。在方案中，我们根据蛋白的物化性质和浙江理工大学硕士学位论文pGEX一2T载体的特点设

5、计构建了两套表达载体。对纯化出的两种NSH2蛋白的溶解性、稳定性和结构展开水平进行了比较，得出的结论能够为其它蛋白的可溶性表达提供指导，能够帮助解决在蛋白纯化中遇到的一些蛋白溶解性不高的问题。最后，我们选择了性质优良的NSH2用于结构研究。关键词：SHP一2；SH2；蛋白溶解性；蛋白稳定性：NMRⅡ浙江理工大学硕士学位论文ExtandpurificationofaminoterminalSH2dlExpresslonandpunlicationamino-terminaldomainofSHP．．2

6、forNMRresearchAbstractSrc-homologyregion2(SH2)domainswerefoundinawidevarietyofmctazoanproteinsinvolvedinsignaltransduction．SH2domains，thataremodulesofabout100aminoacids，canbindphosphotyrosine—containingpeptidemotifsinasequence—specificmanner．Crystals臼m

7、ctIlreresearchesofcomplexesofdifferentSH2domainswimitshigh—affinityphosphotyrosine—containingpeptidesrevealthatthespecificitiesareconferredbythesequencecontextofthephosphotyrosinewithinthetyrosine—phosphorylatedsite，and，morespecifically，bythefiveresidu

8、esimmediatelyC-terminaltothephosphotyrosine．Thespecificitiesarefundamentalandimportanttomanysi即mtransductionpathways．Therefore，SH2domainshavebeenthetargetsofextensivedrugdesignefforts．SrcHomologyRegion2-ContainingProteinTyrosinePhosphat