DB21T2326-2014猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法.doc.doc

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2326—2014猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofpseudorabiesvirus点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2014-7-5发布2014-9-5实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2326—2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫

2、病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶、赵晓彤、于学武、赵凤菊、于长泳、张雅为、刘坤洋、杨国丽、邓文超、高志峰、关淼、李连昭、杨松柏6DB21/T2326—2014猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法1　范围本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus，PRV）gG和gE基因的荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于PRV的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液和细胞培养物中PRV核酸的检测，以及根据免疫背景对gE基因缺失疫苗毒与野毒感染的鉴别检测。本标准中的试验操作应

3、在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3　缩略语下列缩略语适用于本标准。PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus）HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase)Ct值：达到阈值的循环数(cyclethreshold)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonu

4、cleicacid)荧光PCR：荧光聚合酶链式反应(realtimefluozescentquantitativepolymerasechainreaction)PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）4　原理SYBR®GreenⅠ是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与通过PCR反应产生的双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，通过检测反应体系中SYBR®GreenⅠ荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，分析PCR扩增产物的单一性，以达到检测PCR产物扩增量的目的。5　仪器和器

5、材5.1　仪器分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。5.2　器材6DB21/T2326—2014组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。1　试剂和材料1.1　DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4~8℃保存。1.2　SYBR®PremixExTaqTMⅡ（Per

6、fectRealTime）：SYBR®GreenⅠ嵌合荧光法进行RealTimePCR反应的专用试剂，为PCRBuffer、dNTP、RNaseH、HSTaq酶以及SYBR®GreenⅠ染料的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4℃～8℃保存。1.3　PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。1.4　无水乙醇：-20℃预冷。1.5　75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。1.6　阴性对照：灭菌双蒸水。1.7　阳性对照：PRV细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。2　操作步

7、骤2.1　样品的采集、前处理、存放和运送2.1.1　采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。2.1.2　采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。2.1.3　内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。取100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管

8、中编号备用。2.1.4　血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。2.1.5　细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。2.1.6　存放与运送6DB21/T2326—2014采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但