人白介素12植物表达载体的构建

《人白介素12植物表达载体的构建 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、人白介素12植物表达载体的构建【摘要】　　目的：构建人白介素12(hIL12)基因的植物表达载体.方法：采用PCR技术从质粒pCA13hIL12中扩增hIL12基因，SmaI，SacI分别酶切hIL12基因和植物表达载体pBI121，回收，T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121hIL12，双酶切和DNA测序鉴定后，通过三亲杂交法将表达载体pBI121hIL12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101，用PCR法进行鉴定.结果：双酶切及DNA序列测定证实hIL12已插入到表达载体pBI

2、121中，PCR扩增表明构建的重组表达载体pBI121hIL12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论：成功构建了植物表达载体pBI121hIL12，为进一步利用转基因植物生产hIL12奠定了实验基础.【关键词】人白细胞介素12植物表达载体载体构建根瘤菌属0引言　　人白细胞介素12(hIL12)能促进自然杀伤细胞（NK）和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，诱导γ干扰素的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞免疫等多种生物学活性〔1〕，在机体的抗肿瘤、抗病毒、抗过敏过程中发挥极其

3、重要的作用〔2〕.自然状态下,体内IL12含量低，获得较困难.我们构建hIL12基因的植物表达载体，为利用植物基因工程技术生产hIL12基因进行前期准备工作.1材料和方法1.1材料大肠杆菌菌株DH5α,含人IL12的质粒pCA13hIL12由遵义医学院生物化学与分子生物学实验室保存；植物表达载体pBI121由浙江大学馈赠；根癌农杆菌EHA105，GV3101以及辅助质粒pRK2013由华南热带农业大学国家重点实验室馈赠.限制性核酸内切酶（SmaI，SacI），T4DNA连接酶（美国Promega公司）；高

4、保真即用PCR扩增试剂盒、UNTQ10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司）；化学试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1hIL12引物的设计上游引物参考GenBank中cDNA序列进行设计，由上海生工生物工程公司完成，即5＇TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA3＇，其中CCCGGG为SmaI酶切位点；下游引物5＇ACCGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG3＇，其中GAGCTC为SacI酶切位点.1.2.2PCR扩增hIL12基因在0.2mLEppendorf

5、管中加入上、下游引物各3μL，模板pCA13hIL121μL，2×PCRMaster25μL，补去离子水至50μL.扩增条件为94℃10min，94℃1min，64℃1min，72℃2.5min，30个循环，72℃延伸10min.扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，将1600bp左右的目的片段回收纯化.1.2.3重组质粒pBI121hIL12的构建和鉴定PCR产物纯化回收后与载体pBI121经限制性核酸内切酶（SmaI，SacI）双酶切，取回收的PCR产物和载体大片段以浓度比3∶1，16℃连接过夜.转

6、化感受态DH5α细胞，涂布于100mg/L卡那霉素抗性琼脂平板，挑选阳性克隆，碱裂解法小量提取重组质粒，作SmaI，SacI双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司进行测序鉴定〔3〕.构建的重组载体见图1，其中hIL12由P35，P40两亚基的基因经Linker序列连接得到.图1表达载体pBI121hIL12示意图1.2.4pBI121hIL12转化根癌农杆菌采用三亲杂交法：受体菌、供体菌及辅助转移菌分别于3mL含相应抗生素的LB培养基中培养过夜（受体菌，28℃；其余两种37℃过夜培养），按1∶1∶1的比例混合

7、后，取50μL涂布在无抗生素的LB平板上，28℃，过夜培养，待长出菌落后涂布相应的选择平板（含50mg/L卡那霉素、100mg/L利福平、50mg/L链霉素），待长出后，挑单菌落重新在相应的选择平板上进行纯化，挑出纯化后的单个菌落在相应抗性LB液体培养基中28℃，过夜培养，用于鉴定.1.2.5转化农杆菌的PCR鉴定采用文献〔4〕的方法分别提取农杆菌（EHA105，GV3101）中的miniTi质粒，用预先设计的引物进行PCR扩增鉴定，获得可用于遗传转化的农杆菌.2结果2.1PCR方法获取hIL12基因片段以质粒p

8、CA13hIL12为模板，运用PCR方法获得全长hIL12基因（1613bp，图2）.2.2重组质粒pBI121hIL12的鉴定经限制性内切酶SmaI，SacI酶切后得到大小约1600bp和12800bp的大片段，表明hIL12已经克隆到质粒pBI121中（图3）.质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定，通过序列比对分析发现，目