染色质浓缩对细胞核dna含量检测的影响

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1、染色质浓缩对细胞核DNA含量检测的影响作者：魏清柱，夏潮涌，刘江欢【摘要】目的利用三种不同方法制备小鼠肝细胞涂片，探讨染色质浓缩对图像分析仪测量DNA含量的影响。方法本文选取10只成年健康雄性小鼠，采用传统涂片、液基制片法和甲醛固定后液基制片法制备小鼠肝细胞涂片，Feulgen染色，TIGER细胞图像分析仪分别测量三种涂片内肝细胞核的积分光密度、平均光密度和面积。结果三种涂片内肝细胞核分布均匀，轮廓清晰，呈紫红色，与传统涂片法相比，液基法内肝细胞核面积明显减小，染色质高度浓缩；相同倍体的肝细胞核在传统涂片中面积最

2、大，平均光密度最低，各倍体间的比值最接近2和4，积分光密度CV值最低（<3.5）。固定法和液基法平均光密度明显升高，各倍体间比值明显偏离2和4，积分光密度CV值>6。结论不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度产生明显差异，染色质浓缩可导致平均光密度值升高，积分光密度值降低，测量结果的精确性和准确性降低。【关键词】染色质浓缩；图像分析仪；DNA含量；肝细胞涂片Abstract:PurposesToinvestigatetheinfluenceofnuclearchromati

3、ncondensationonmeasurementofDNAcontent.MethodsSmearsoflivercellsfromtenratsplesfromlivertissuefixedin4%bufferedformaldehyde.ATIGERimageanalysissystemeasureIOD,AODANDAvalueofthenuclEi.ResultsTheamaranthinenuclEIhadadistinctoutlineanddistributedevenlyontheslide

4、.Theareaofnucleiinliquidbasedpreparationuchsmallerandchromatinorecondensedinparisonear.ThenucleiinconventionalsmearshadthelargestvalueofareaandthevalueofAOD,andCVofIOD,theIODratioamongdiploid,tetraploidandoctaploidDNAostcloseto2and4,andtheCVofIODexceeded6%.C

5、onclusionThesamespecimenmayhavedifferentdegreeofchromatincondensationcausedbydifferentpreparationprocedures.ChromatincondensationcanincreaseAODanddecreaseIODvalue,andfinallytheaccuracyandprecisionofICMatincondensation,;imageanalysissystem;DNAcontent;cellsmear

6、以往研究发现，不同类型细胞之间及相同类型细胞处于不同功能状态时，染色质浓缩的程度有所差异，这种差异会影响DNA倍体分析结果的精确性和准确性［1～5］。我们在实践中发现，不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度有明显差异，由此对图像分析系统测量结果精确性和准确性的影响国内尚未见相关研究，本文对此加以讨论。1材料与方法　　1.1传统涂片制备正常成年雄性昆明小白鼠10只，断髓，开腹，门静脉灌注肝脏，游离肝脏。将肝脏分为二部分，一部分置于筛网中，机械研磨分离肝细胞，载玻片刮取肝细胞悬液，均匀推于

7、另一载玻片上，95%乙醇固定15分钟。1.2液基细胞学标本制备载玻片刮取肝细胞悬液，将其置于保存液（美国利普液基系统）中振荡，反复多次。取3.0ml保存液放入试管中，加入5.0ml清洁液，离心后倾倒液体，在沉淀物中加适量细胞基液，同一张载玻片上制得二个直径2.0cm细胞薄片。1.3甲醛固定后液基细胞学标本制备将剩余肝脏置于10%福尔马林溶液中固定24小时，固定后肝脏置于筛网中，机械研磨分离肝细胞，PBS缓冲液冲洗，游离肝细胞收集于筛网下烧杯中，取5.0ml左右肝细胞悬液放于试管中，离心后倾倒液体，沉淀物中加适量细

8、胞基液，同一张载玻片上制得二个直径2.0cm细胞薄片。1.4Feulgen染色取上述三种肝细胞涂片，流水冲洗，5NHCl水解50分钟，Schiffs试剂染色60分钟，温度为25～30℃，0.5%偏重亚硫酸钠漂洗1分钟×3次，自来水冲洗5分钟，蒸馏水漂洗3分钟×3次，常规脱水封片。1.5肝细胞核参数的测量按柯勒照明要求调整OLYMPUSBX51多功能显微镜光源，使用20×