当归多糖硫酸酯的合成及其对脾细胞增殖的作用论文

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1、当归多糖硫酸酯的合成及其对脾细胞增殖的作用论文.freelgg-1，产率为0.737～0.884gg-1.当归多糖及其硫酸酯在剂量为500mgL-1和1500mgL-1时，给药组光密度明显高于对照组（P0.01），作用与剂量有良好的正相关性.结论提高氯磺酸的比例，可以提高产物的硫含量，但收率降低.当归多糖及其硫酸酯对活化的T细胞增殖有直接促进作用.Keyousesplenocyteproliferation.METHODSAn-gelicaSinensispolysaccharide（AP-Ⅰ）ethod;theestersulfateatedturbidimetr

2、icallyasbariumsulfate;theeffectsofAPSsonmousesplenocyteproliferationgg-1.BothAP-ⅠandAPSsenhancedmousesplenocytepro-liferationatdose500mgL-1and1500mgL-1（P0.01）.CONCLUSIONByincreasingtheratioofchlorosulfonicacid.freelotingeffectsonactiveTcellproliferation.0引言多糖作为非特异性免疫调节剂在抗肿瘤、抗肝炎、抗衰老等方面受

3、到广泛关注.20世纪60年代以来陆续发现，一些半合成硫酸化多糖，如香菇多糖、右旋糖酐、牛膝多糖的硫酸化衍生物，是多种有胞膜病毒的强大抑制剂，尤其是具有抗HIV-Ⅰ的活性，引起广泛的重视.在体内、外实验中，硫酸化多糖均表现出良好的抗病毒作用.日本学者研究了海藻中的天然硫酸化多糖，发现其在体内具有抗肿瘤作用，而体外无效［1］.硫酸化多糖的免疫促进活性被认为是整体情况下抗病毒、抗肿瘤作用的重要机制之一.中药当归（AngelicaSinensis，Oliv）中水溶性多糖具有增强免疫系统功能的作用［2］.我们选择从新鲜当归中提取的水溶性当归多糖（AP-Ⅰ），对其进行硫酸酯化修

4、饰，探讨氯磺酸用量对收率和产物硫含量的影响，并比较了当归多糖及其硫酸酯对小鼠脾细胞增殖反应的影响，为进一步研究其活性奠定基础.1材料和方法1.1材料①主要试剂及仪器:BECKMANDU-600型紫外可见分光光度计（USA）;DG3022A型酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）;PE-983红外光谱仪（F）为国产分析纯，吡啶、DMF使用前重蒸并干燥;MTT，Sigma产品;RPMI1640培养液，Gibco产品.②动物:6～8周龄的BABL/c纯系小鼠，雄性，18～22g，由本校实验动物中心提供.1.2方法①当归多糖的提取:采自岷县的新鲜当归，经水煮、醇沉、透析、除蛋白

5、、冷冻干燥，得纯白色粉末状当归多糖，其中糖的含量为97%，蛋白的含量为3%.②多糖硫酸酯的合成用氯磺酸-吡啶法［3，4］，将吡啶60mL加入附有冷凝管和搅拌装置的500mL三颈瓶中，冰盐浴冷却下，用恒压漏斗慢慢滴入氯磺酸4～25mL，约10～40min滴加完毕，烧瓶中出现大量淡黄色固体.AP-Ⅰ4.0g，混悬于120mLDMF中，超声波处理20min后，加入三颈瓶.立即将三颈瓶移入预热至约100℃的石蜡浴中，恒温反应1h.冷至室温，将反应液倾入冰水中，2.5molL-1NaOH调至中性，加入三倍体积无水乙醇，析出沉淀.离心收集沉淀，并将沉淀溶于适量水，用去离子水透析

6、3d，未透液经浓缩、冷冻干燥得淡黄色当归多糖硫酸酯（APS）.③糖含量分析用硫酸-苯酚法［5］;硫含量分析用BaSO4比浊法［6］;同时还用紫外光谱分析和红外光谱分析.④脾细胞增殖反应常规制备小鼠脾细胞，调整细胞浓度为（5×109）L-1，加入96孔圆底培养板，设对照组:100μL细胞悬液+100μL1640培养液;加药组:100μL细胞悬液+80μL1640培养液+20μL药物.每个药物浓度设3个复孔，37℃50mLL-1CO2下培养72h后，MTT法［7］测定结果.统计学处理:实验结果进行t检验.2结果2.1氯磺酸对反应的影响固定吡啶的用量，提高氯磺酸的比例，氯

7、磺酸-吡啶盐（淡黄色固体）生成增多至出现板结，搅拌困难，加入DMF可溶解，多糖易被酯化，产率降低，产物颜色加深呈红褐色，但取代度（DS）高.降低氯磺酸比例，可以提高产率，但取代度低（Tab1）.表1氯磺酸浓度对多糖硫酸化反应的影响略当归多糖硫酸酯的紫外光谱和红外光谱分析结果一致.除显示当归多糖母体的特征吸收外，紫外光谱在260nm处，红外光谱在1240cm-1和820cm-1附近有硫酸酯键的特征吸收，且与当归多糖相比产物的羟基吸收也大为减小，也表明部分羟基被酯化.2.2脾细胞增殖反应在500mgL-1和1500mgL-1剂量下，当归多糖及其硫酸酯均能显著促进脾细