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青蒿素对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长和淋巴管生成的影响作者：郭燕，王俊，章必成，陈正堂，高建飞，赵勇【关键词】青蒿素；癌,LeisininonmetastatictumorgrophangiogenesisinmicebearingLea 【Abstract】AIM：ToexploretheeffectofantimalarialartemisininonLeoma(LLC)groorlymphangiogenesis.METHODS：ThemodelsofLLCinC57BL/6miceouseLLCcells.Aftermiceinisteredisininat50mg/kgbodyorseasuredorcellinjection,andLeorsandlungsorsandlungsmunohistochemicalanalysisforlymphangiogenesisusingVEGFR3andLYVE1stainingorformicrometastasisusingHEstaining.Lymphaticmicrovesseldensity(LMVD)phaticvesselcount.Furthermore,miceonitoredforsurvivalstudies.RESULTS：LMVD,beroflungmetastasisinartemisinintreatedgrouporgroisinintreatedmiceandcontrolmice(P>0.05).Inaddition,artemisinintreatedmicelivedsignificantlylongerthanthecontrolmicedid(P<0.01).CONCLUSION： Antimalarialartemisinineffectivelyinhibitsthelymphangiogenesisandlungmetastasis,andenhancesthesurvivalofmicebearingLLC. 【Keyisinin;carcinoma,Lephangiogenesis;vascularendothelialgrouthfactorc 【摘要】目的：探讨抗疟药青蒿素对Leg/kg的青蒿素，1次/2d，连续给药2phangiogenesis），并促进肿瘤细胞通过新生的淋巴管向区域淋巴结转移.目前，多种淋巴管内皮特异性标记物的发现促进了人们对肿瘤淋巴管功能的认识，因此寻找可以抑制淋巴管生成的药物和方法已经成为抗肿瘤转移研究领域的热点［1］.青蒿素（artemisinin）是1972年由我国科研人员从中药青蒿中分离得到的，具有抗疟作用的单体成分，现在临床上主要用于治疗耐药的恶性疟疾.多项研究表明，青蒿素及其衍生物对多种肿瘤的生长具有抑制作用，并显示出较强的抗血管生成活性［2］.然而，青蒿素是否可以抑制淋巴管生成还不清楚.我们探讨了青蒿素对小鼠LeL/L灭活胎牛血清、100U/mL青、链霉素）培养基，置于37℃，50mL/LCO2孵箱中培养.DMEM、胎牛血清购于美国Hyclone公司.胰蛋白酶，美国BD公司.青蒿素购自重庆市酉阳县武陵山制药有限公司，研磨后用5g/L的羧甲基纤维素钠配成悬浮液.兔抗小鼠VEGFR3, LYVE1多克隆抗体购买自美国SantaCruzBiotechnology公司.免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司.收集对数生长期的细胞，胰酶消化后，1000r/min离心10min，PBS洗涤，无血清的DMEM制成细胞悬液，细胞浓度达到5×106.随机选取6周龄的C57BL/6小鼠，在背部皮肤下接种LeL. 1.2方法将20只小鼠随机分为对照组和青蒿素治疗组，每组10只，青蒿素治疗组在肿瘤移植后2d即灌胃给予50mg/kg青蒿素0.4mL，1次/2d，连续给药2L/LH2O2室温封闭10min，98℃微波热修复抗原10min.SABC染色步骤如下：先用20mL/L正常山羊血清封闭30min，甩去不洗，随后滴加兔抗小鼠VEGFR3及LYVE1（1∶500），4℃过夜，PBS洗涤，滴加生物素化的羊抗兔IgG（1∶100），37℃孵育30min，PBS洗涤，加入SABC，37℃孵育30min，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木素衬染，中性树胶封片.光镜下观察微淋巴管密度（lymphaticmicrovesseldensity,LMVD）并计数，参考Beasley等的方法［3］，即先在低倍数下（×100）观察切片，寻找肿瘤内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇，作为一个微淋巴管，含有肌层的细胞不以计数，每个标本在高倍镜下（×400）随机计数10个视野，取平均数作为该LMVD值. 统计学处理：计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件包进行分析.两率的比较用Fisher确切概率法，均数比较用t检验，生存率估计用KaplanMeier法，并用logrank检验，P<0.05表示差异具有统计学意义. 2结果 2.1Le. 2.2Lephanticvesselinvasion,LVI）是独立的非小细胞肺癌预后指标［4］.在实体肿瘤中，肿瘤细胞或其他间质细胞高表达（vascularendothelialgrog/kg的青蒿素可以显著延长荷瘤小鼠生存期，但并未减轻肿瘤负荷.提示青蒿素对Lephangiogenesistopreventtumourmetastasis［J］.BrJCancer,2006,94(10):1355-1360. ［2］EfferthT,BenakisA,RomeroMR,etal.Enhancementofcytotoxicityofartemisininstoorallymphangiogenesisandlymphnodemetastasisinheadandneckcancer［J］.CancerRes,2002,62(5):1315-1320. ［4］TakanamiI.LymphaticmicrovesseldensityusingD240isassociatedetastasisinnonsmallcelllungcancer［J］.OncolRep,2006,15(2):437-442. ［5］StakerSA,AchenMG,JussilaL,etal.Lymphangiogenesisandcancermetastasis［J］.NatRevCancer,2002,2(8):573-578. ［6］李宏宏,雷霆,司履生.VEGFC与乳腺癌的关系［J］.第四军医大学学报,2002,23(B1):44-46. ［7］ChenHH,ZhouHJ,FangX.InhibitionofhumancancercelllinegroanumbilicalvEinendothelialcellangiogenesisbyartemisininderivativesinvitro［J］.PharmacolRes,2003,48(3):231-236. ［8］EfferthT,OlbrichA,BauerR.mRNAexpressionprofilesfortheresponseofhumantumorcelllinestotheantimalarialdrugsartesunate,arteether,andartemether［J］.BiochemPharmacol,2002,64(4):617-623. ［9］PaderaTP,KadambiA,diTomasoE,etal.Lymphaticmetastasisintheabsenceoffunctionalintratumorlymphatics［J］.Science,2002,296(5574):1883-1886. ［10］SkobeM,HaorlymphangiogenesisbyVEGFCpromotesbreastcancermetastasis［J］.NatMed,2001,7(2):192-198. ［11］ChenHH,ZhouHJ,alarialartemisininsynergizesmatorycytokinerelease［J］.AntimicrobAgentsChemother,2006,50(7):2420-2427. ［13］周宏志,顾晓明,王春梅.小鼠淋巴管瘤的诱导与组织病理学观察［J］.第四军医大学学报,2002,23(4):295-297.
