eb病毒gp85 n端片段的原核表达与初步鉴定

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1、EB病毒gp85N端片段的原核表达与初步鉴定涂向东吴玉水邱龙翔连云宗程烽兰风华朱忠勇【关键词】EB病毒;,gp85,N端片段;,表达;,免疫原性　　ProkaryoticexpressionandcharacterizationofNterminaltruncatedglycoproteingp85ofEpsteinBarrvirus　　[Abstract]AIM:ToconstructaprokaryoticrebinantvectorofEpsteinBarrvirus(EBV)membraneproteingp85,toexpresstheproteininE.coliandcharac

2、terizetheantigenicityofthisnonglycosylatedprotein.METHODS:TheBXLF2genecoding5＇terminaltruncatedofEBVgp85plifiedfromtheEBVstrainB958celllineers.AfteridentificationbytherestrictiondigestionidpGEX5Tandconfirmedbysequencing.TheconstructedprokaryoticexpressionvectorpGEX5T85NedintothepetentE.coliBL21.Thee

3、xpressedrebinantproteingp85Natography,characterizedbyr）约为45000,同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测获得了高效价的抗血清,且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。ED公司。抗gp85的单克隆抗体（mAb）由美国Florida大学HuttFletcher博士赠送。其他常规化学试剂均为分析纯。PE2400型DNA扩增仪ABI公司产品。TransBlotSD半干电转印仪及FluorSTMMultilmager凝胶成像系统为BioRad公司产品。　　1.2方法　　1.2.1BX

4、LF2基因N端片段的PCR扩增根据EB病毒的膜蛋白gp85BXLF2基因的序列,设计一对引物。P1:5＇CGAAGCTTTGCAGTTGCTCTGTGTT3＇含HindⅢ酶切位点,P2:5＇CGCTCGAGATGCAGTTGCTCTGTGTT3＇含XhoⅠ酶切位点。以EB病毒B958细胞为模板,总PCR反应体积为50μL,包括引物P1、P2各30pmol,dNTP125μmol/L及TaqDNA聚合酶2U。PCR扩增条件:94℃预变性2min,94℃30s,50℃30s,72℃45s,共30个循环后,于72℃再延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。　　1.2.2重组质粒的

5、构建和转化将上述PCR产物分别用HindⅢ和XhoⅠ双酶切,并与同样双酶切的GST融合表达载体pGEX5T进行连接,构建pGEX5T85N。以重组质粒转化感受态E.coliBL21细胞,阳性克隆进行双酶切鉴定,并将菌液送上海生物工程公司进行DNA序列测定。　　1.2.3GSTgp85N融合蛋白的诱导表达挑取重组菌的单个菌落,接种于25mLLB(含氨苄青霉素)培养基中,于37℃摇床培养过夜。次日,按1∶30转种于500mLLB培养基中,于37℃振荡培养至A600=1.0左右,加IPTG（终浓度为0.4mmol/L）于18℃诱导表达20h;同时取1管未加IPTG作为阴性对照。菌液离心,收集菌体,重

6、悬于8mLPBS（含10mL/LTritonX100及1g/L溶菌酶）中,于-70℃反复冻融以裂解菌体。以10000g离心收集上清和菌体沉渣,分别取少量进行100g/LSDSPAGE。　　1.2.4重组蛋白的纯化取上述菌体的裂解上清,按说明书的方法,用谷胱甘肽亲和层析柱进行分离纯化,纯化产物的纯度经100g/LSDSPAGE进行分析。　　1.2.5小鼠抗gp85N抗血清的制备以Bradford法测定蛋白浓度,按100μg纯化的gp85N抗原加入等体积的福氏完全佐剂,乳化后采用皮内、背部多点注射免疫5只6周龄的BALB/c雌性小鼠。初次免疫后,每隔3周用同样抗原加等体积福氏不完全佐剂加强免疫2次

7、。　　1.2.6抗血清效价的测定经优化条件,将纯化的gp85N抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至10mg/L包被酶标微孔板,于4℃过夜。以PBS洗涤后,加含10g/LBSA的PBS封闭2h。充分洗涤后,分别加入不同稀释度和不同免疫周期的小鼠血清及抗gp85mAb,同时以PBS免疫小鼠的血清作为空白对照,以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗,用底物TMB显色后,于波长450nm处测定抗血清的效价。