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时间:2018-11-04
《腺病毒穿梭质粒pshuttle cmv》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV【摘要】目的构建腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1,为构建表达具有抗原表位标记的血管内皮生长因子121(vascularendothelialgroeraseChainReaction,PCR)技术对pTG19T-VEGF121携带的VEGF121基因突变,以去除翻译终止密码子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。将突变后的VEGF121基因(+VEGF121)定向连入腺病毒穿梭质粒pSh
2、uttleCMV-IRES-hrGFP-1,通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果重组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论成功构建了pShuttleCMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1。【关键词】腺病毒穿梭载体;血管内皮生长因子121Abstract:ObjectiveToclonevascularendothelialgroidpShuttleCMV-IRES-hrGFP-1,preparingforconstructionofanovelrebinantadenovirusve
3、ctorexpressingtheVEGF121fusedtoFLAGepitopeandhumanizedRenillareniformisgreenfluorescentprotein1(hrGFP-1)asareporteronthesametranscript.MethodsTheVEGF121genecontainedintheplasimidofpTG19T-VEGF121oved.Meanutantthroughpolymeraschainreaction(PCR)mutagene
4、sistechnology.ThemutantofVEGF121gene(+VEGF121gene)ultiplecloningsitesoftheadenovirusshuttleplasmidpShuttleCMV-IRES-hrGFP一1bythedirectionalcloningmethod.ToidentifythecorrectrebinantstheanalysisofsequencingandelectrophoresisapoftherebinantaccordedidpSh
5、uttleCMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1hasbeenconstructedsuccessfully. Keyid;vascularendothelialgroRNA编码序列可产生六种不同的异构体,其中其中以VEGF165和VEGF121的作用最为显著,但由于VEGF165以一半可溶性,一半不可溶性蛋白在机体内表达,可分泌到细胞外,但一部分与细胞膜或细胞间质结合,而VEGF121则全部为可溶性,不结合于肝素的弱酸性蛋白质,完全分泌到胞外并游离于细胞间质,可以更好的发挥旁分泌的
6、作用,促进血管生成[6]。本实验利用hrGFP-1为报告基因,构建含VEGF121和hrGFP-1基因的穿梭载体,为进一步研究VEGF121在体内的表达和促血管生成及成骨的活动打下基础。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1质粒和菌株pTG19T-VEGF121质粒购自上海东方肝胆外科研究所;腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1购自Stra-tagene公司;pMD19-T和大肠杆菌感受态DH5α购自TaKaRa公司。 1.1.2主要试剂、试剂盒各种限制性内切
7、酶、DNALigationKitVer.2.0、高保真DNA聚合酶、AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0、TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.0质粒小量提取试剂盒、dNTP、DL15000等购自TaKaRa公司。 1.2方法 1.2.1VEGF121基因的突变及携带突变后VEGF121基因(记作+VEGF121)的pMD19-T质粒的亚克隆:①以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去
8、除VEGF121基因中终止密码子TAG序列,之后在基因序列前后分别加入NotI和XhoI酶切位点:引物序列: F:5′-GCGGCCGCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′ R:5′-CTCGAGCCGCCTCGGCTTGTCACATT-3′ 以pTG19T-VEGF121为模板,进行PCR反应,反应条件:98℃,10s,30cycles;55℃,5s,3030cycles;72℃,30s,30cycles;72℃,5min,1cycles,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②PCR产物加“A
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