幽门螺杆菌ahpc基因的克隆与原核表达

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1、幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达：李艳青，段广才，宋春花，张建光，王淑玲，张卫东，郗园林【摘要】目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)ahpC基因的原核表达系统，表达并纯化Ahp蛋白。方法用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段，将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组质粒pET30a-ahpC。重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。结果PCR扩增的ahpC基因长度为594bp，经酶切和测

2、序分析，插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%；SDS-PAGE显示，经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白，且产量较高。结论成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC，并在大肠杆菌中高效表达。【关键词】幽门螺杆菌；ahpC基因；克隆；基因表达ChinaABSTRACT:ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionsystemofahpCgeneofHelicobacterpylori.MethodsTheahpCgeneplifiedfromHpchromosomalDNAbyPCRtechniq

3、ueandclonedintotheexpressionvectorpET-30a.TherebinantvectorpET30a-ahpCedtoE.coliBL21(DE3)forexpressionunderinductionbyIPTG.Theexpressionproductentthat.ConclusionAprokaryotichigh-expressionsystemforahpCgenehasbeensuccessfullyconstructed.Itcanhighlyexpressr-AhpCproteininE.coli.　　KEYEL-Hp2

4、7(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-TVector、Proteinmarker、T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1Hp基因组DNA的提取　　刮取经3d培养的

5、Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取HpDNA。　　1.2.2AhpC编码基因的扩增　　根据GenBank上公布的HpahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下划线为NdeⅠ酶切位点；P2的序列为：5′-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点。以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃

6、预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。　　1.2.3重组载体的构建　　回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pMD18-T载体1μL、PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经蓝白斑筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22

7、℃进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET30a-ahpC再经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.2.4重组质粒的转化　　将重组载体pET30a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养12～16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。抽提质粒，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任公司完成。　　1.2.