SNT1135.9-2010马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１３５．９—２０１０马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犚犪犾狊狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犪犮犲犪狉狌犿（犛犿犻狋犺）犢犪犫狌狌犮犺犻犲狋犪犾．１９９６２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１１３５．９—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言ＳＮ／Ｔ１１３５标准分为以下部分：———马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；———马铃薯黄化矮缩病毒

2、检疫鉴定方法；———马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；———马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；———马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；———马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法；———马铃薯Ａ病毒检疫鉴定方法；———马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法；———马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法。本部分为ＳＮ／Ｔ１１３５的第９部分。本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。

3、本部分主要起草人：易建平、周国梁、印丽萍、王有福、于恒纯。Ⅰ犛犖／犜１１３５．９—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法１范围ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分规定了进出境植物检疫中马铃薯青枯病菌犚犪犾狊狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犪犮犲犪狉狌犿ｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２的检测和鉴定方法。本部分适用于进出境马铃薯块茎及其产品、番茄种苗及其产品和天竺葵种苗及其产品中马铃薯青枯病菌的检测和鉴定。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不

4、注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１１５７进出境植物苗木检疫规程ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１８０９进出境植物种子检疫规程ＳＮ／Ｔ２１２２进出境植物及植物产品检疫抽样３原理马铃薯青枯病菌犚．狊狅犾犪狀犪犮犲犪狉狌犿ｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２属细菌域Ｂａｃｔｅｒｉａ，变形菌门Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，变β形菌纲Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，伯克氏菌目Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ，伯克氏菌科Ｂｕｒｋ

5、ｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ，劳尔氏菌属犚犪犾狊狋狅狀犻犪。马铃薯青枯病菌的分布、寄主范围、为害症状和生理生化特性等相关信息参见附录Ａ。根据青枯病菌对不同寄主植物的致病性差异，青枯菌划分为５个小种（参见附录Ｂ），马铃薯青枯病菌属于３号小种，主要侵染马铃薯和番茄。根据青枯病菌对三种双糖（麦芽糖、乳糖和纤维二糖）和三种乙醇（甘露醇、山梨醇和卫矛醇）氧化产酸能力的差异将青枯菌分为４个生物型（参见附录Ｂ），马铃薯青枯病菌属于生物型２（只能氧化３种双糖，不能氧化３种乙醇）。马铃薯青枯病菌的形态特征、生物学特性、致病性

6、反应以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据。４仪器设备和用具超净工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪刀、ＰＣＲ仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、凝胶成像系统、ＢＩＯＬＯＧ微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。５药品试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。蛋白胨、甘油、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、溴化乙锭（ＥＢ）、琼脂糖和ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。ＳＭＳＡ培养基配方见附录Ｃ，ＥＬＩＳＡ试验所需药品试剂见附录Ｄ，ＰＣＲ试验和实时荧光ＰＣ

7、Ｒ试验所需药品试剂见附录Ｅ。１犛犖／犜１１３５．９—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６检测鉴定６．１检测鉴定流程马铃薯青枯病菌的检测鉴定流程图如图１所示。图１马铃薯青枯病菌的检测鉴定流程图６．２初筛按照ＳＮ／Ｔ１１５７、ＳＮ／Ｔ１８０９和ＳＮ／Ｔ２１２２中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室内对样品进行症状检查，马铃薯块茎可以通过切开块茎来检查内部症状。如检查发现茎剖面维管束变色等典型症状（参见附录Ａ），取样品病健交界处进行病菌分离；未发现典型症状的样品，用ＥＬＩＳＡ（见附录Ｄ）或ＰＣＲ（见附录

8、Ｅ）方法进行初筛检测。经初筛检测，阳性样品进行病菌分离。６．３分离具有典型症状的样品在显微镜下观察有无喷菌现象，取植物组织于灭菌水中，可以看到云雾状细菌从切口处喷出。取典型症状样品病健交界处组织或初筛阳性样品组织少许于１ｍＬ～５ｍＬ灭菌水中，静置１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，让细菌从染病组织中游离出来。取组织处理液１ｍＬ进行１０倍系列稀释，分别为１０倍、１００倍和１０００倍稀释液，将每个浓度的稀释液分别进行分离。用无菌接种环蘸取样品处理液在ＳＭＳ