抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定.doc

《抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定【摘要】［目的］探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性［方法］采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验，检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9KScFvA7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量；应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性［结果］毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达，分子质量约为44ku；间接免疫荧光试验显示，在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现［结论

2、］单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达，并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.【关键词】单链抗体受体胆碱能重症肌无力ABSTRACT:OBJECTIVETodeterminethespecificityofexpressedsinglechainvariablefragment(ScFv)A7ofantibodyagainstacetylcholinereceptor(AChR)inmyastheniagravisinPichiapastorisMETHODSThemolecularweightofexpresse

3、dprotein(ScFvA7)wasanalyzedbysodiumdodecylsulfateolyacrylamidegelelectrophoresis(SDSAGE)andWesternblotting.TheaffinityofexpressedproteintoAChRinmouseintercostalsmuscleswasdetectedusingindirectimmunofluorescencetechnologyRESULTSThetargetproteinwassecretedinth

4、esupernatantofexpressionculturemedium.Itsmolecularweightwasabout44ku.TherewasfluorescencebetweenthemouseintercostalsmusclecellsCONCLUSIONThetargetproteinhasbeenexpressedfromPichiapastorisGS115successfullyanditcanbindtotheAChRinmouseintercostalsmuscles.Keywords

5、:singlechainvariablefragment;receptor,cholinergic;myastheniagravis重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫性疾病，目前对它的治疗主要以非特异性免疫治疗为主，此方法虽然可以在一定程度上减轻患者的临床症状，降低死亡率，但可引起广泛的免疫抑制等严重的副作用.特异性免疫治疗还处于动物实验阶段，包括口服或经鼻黏膜给予乙酰胆碱受体诱导免疫耐受，导入融合FasL基因的抗原提呈细胞以杀伤反应性T细胞，而T细胞表位多肽疫苗抑制自身反应性T细胞的增殖，单价抗体特异性

6、封闭抗原，以乙酰胆碱受体为配基制备免疫吸附剂，以去除血液中的致病性抗体等［1～3］.由致病性抗体制备的单链抗体（singlechainvariablefragment,4ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后可特异性地封闭致病性抗体的结合位点，阻止乙酰胆碱受体发生抗原调变，同时由于单链抗体没有可结晶片段（Fc段），无法激活补体，可以起到保护性作用［4］.由于单链抗体分子质量更小，易于穿过血管壁进入组织，且易于基因操作，因此对它的研究逐渐被受重视.抗乙酰胆碱受体单克隆抗体A7为高致病性抗体［5］，由它制备得到的

7、单链抗体A7应仍然保留着与乙酰胆碱受体较高的结合活性，并能够抑制致病性抗体对乙酰胆碱受体的结合.本实验的目的是探讨单链抗体A7在毕赤酵母表达产物的特性，对重症肌无力的基因治疗研究提供实验依据.1材料与方法1.1实验动物及试剂实验动物取Wistar大鼠，由延边大学医学部实验动物科提供.考马斯亮蓝为美国Sigma公司产品，G418、牛血清白蛋白（BSA）及生物素为华美生物工程公司产品，150g/LNextGel蛋白电泳溶液及吐温20（Tween20）为Amresco公司产品，鼠抗cmyc单克隆抗体为Santa

8、Cruz公司产品，辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体、二氨基联苯氨（DAB）染色液及PBS为北京鼎国公司产品.1.2重组表达载体pPIC9KScFvA7的构建及表达由延边大学基础医学院免疫学与病原生物学研究室构建并表达.应用聚合酶链反应技术构建重组表达载体pPIC9KScFvA7，用SalⅠ酶切质粒pPIC9KScFvA7使之线性化后电转化