干扰afp蛋白表达的shrna表达载体的构建及活性鉴定

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1、干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定作者：张国英刘明社赵中夫*张芸杨慧武延隽【摘要】　　目的：利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表达的载体，并进行活性鉴定。方法：设计表达短发夹RNA的互补DNA序列，经退火成双链，克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中，构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5α菌株，扩增，提取质粒，酶切鉴定后测序分析。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞，检测转染率和培养细胞上清

2、的AFP含量变化，确定重组质粒的活性。结果：构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论：成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。【关键词】AFP蛋白　RNAi　shRNA　重组质粒载体AbstractObjective：Toconstructtherecombina

3、ntplasmidexpressingtwoAFP-targetedshorthairpinRNA(shRNA)withpGenesil-1plasmidsvector,andDetecttheActivityof11RecombinantPlasmidinHepG2cells.Methods：TwopairsofDNAsequencesweredesignedandsynthesized,andformedcomplementarychainsbyannealingrespectively.Thentheobtained

4、products,siAFP1andsiAFP2,wereinsertedintoplasmidvectorpGenesil-1withU6promoter.TherecombinantplasmidsweretransformingintotheEscherichiacolistrainDH5αforscreeningandamplifying.ThesequenceanalysisoftheplasmidsandidentifiedbySalIdigestionwascarriedout.Thebiologicalac

5、tivityofrecombinantplasmidwasdetectedbytransfectingintotheHepG2cellline.Results：ThetwoAFP-targetedshRNAsexpressingframeweresuccessfullyinsertedintothepGensil-1plasmidvectorrespectively,andtheobtainedshRNAscodingsequenceswereconsistentwiththedesignedfragments.There

6、combinantplasmidinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.Conclusion：TheconstructionoftworecombinantplasmidsofAFP-targetedshRNAwassuccessful.TworecombinantplasmidsexpressingAFP-targetedshRNAinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.KeyWor

7、dsAFP；RNAinterference；ShorthairpinRNA；HepG2cells11长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌(HCC)的诊断指标之一。诸多研究关注于检测甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）对原发性肝癌诊断运用，而对AFP和肿瘤细胞发生及增殖的关系并不完全清楚［１～3］。近年发展起来的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术为探索AFP的生物学功能提供了有力的工具。RNAi技术是通过导入细胞19nt～23nt的小分子干扰RNA(small

8、interferenceRNA,siRNA)，降解同源mRNA，高效、特异性阻断目的基因表达［４～7］。本研究针对人AFP基因设计了2个位点的shRNA表达序列，用人U6启动子和RNApolymeraseⅢ(PolⅢ)终止信号，构建针对AFP的特异性shRNA真核表达载体，并转染HepG2细胞鉴定活性，