16 生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶

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1、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶【目的】1．掌握电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的原理与技术。2．熟悉测定血清乳酸脱氢酶同工酶的临床意义。【原理】体内LDH同工酶均由四个亚基组成。亚基分二种，即“H”亚基（多分布于心肌）与“M”亚基（多分布于肌肉）。根据亚基不同，LDH同工酶分为以下五种（表3-8）。表3-8LDH同工酶的分类与组成分类亚基组成LDH1LDH2LDH3LDH4LDH6HHHH(H4)HHHM(H3M)HHMM(H2M2)HMMM(HM3)MMMM(M4)由于LDH同工酶的亚基组成不同，在pH8.6巴比妥缓冲液中所带电荷不同，通过醋酸纤维薄膜电泳可以将血清

2、样品中的各种LDH同工酶彼此分开。以乳酸钠（钾）为基质，在有氧化型辅酶Ⅰ存在时，LDH可是乳酸脱氢生成丙酮酸、使NAD+还原为NADH+H+，NADH+H+又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS），PMS再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝（NBT)，使其还原为紫蓝色化合物，因此有LDH活性的区带即着紫色，生成颜色深浅与LDH活性成正比。其反应如下：将电泳后的醋酸纤维薄膜与含有底物乳酸和显色剂的染色液一起保温，便可显示出血清LDH同工酶的谱带（图3-8）。将各谱带洗脱进行比色分析，即可求得各同功酶的相对百分比。图3-8LDH同工酶电泳图谱【器材】1．电泳仪2．电泳槽（用二层滤纸或纱布搭桥

3、）3．恒温水浴4．分光光度计5．点样器6．白瓷盘7．玻璃板8．镊子【试剂】1．pH8.6巴比妥电泳缓冲液（离子强度0.05）巴比妥钠20.6g，巴比妥3.68g，蒸馏水加至2000ml。2．pH7.5磷酸盐缓冲液（0.1M）磷酸二氢钾2.16g，磷酸二氢钠30.13g，蒸馏水加至1000ml。4℃冰箱保存。3．吩嗪二甲酯硫酸盐液吩嗪二甲酯硫酸盐0.5g，蒸馏水加至500ml。4．氯化硝基四氮唑蓝液氯化硝四氮唑蓝1.25g，加入pH7.5的磷酸盐缓冲液至300ml(温水助溶过滤)。5．1M乳酸钠液（或0.5M乳酸钠液）取70%～80%液体乳酸钠8ml，加水至200ml为0.5M乳

4、酸钠液。取70%～80%液体乳酸钠16ml，加水到200ml为1M乳酸钠液。6．染色应用液NAD+40mg，0.1M磷酸盐缓冲液4ml，氯化硝基四氮唑蓝12ml，1M乳酸钠4ml，吩嗪二甲酯硫酸盐1.2ml，混合即可。临用前配制，避光保存。7．洗脱剂氯仿9份，无水乙醇1份，混匀。8．固定液10%冰醋酸。【操作】1．准备将醋纤膜浸入pH8.6巴比妥缓冲液中浸泡15～20min（注意：先让膜漂浮在液面，待膜全部湿润后在将膜浸入液内）。取出后用干滤纸吸去多余的水分。2．点样将血清样本用小吸管吸出置于载玻片上，用点样器充分蘸满血清，然后将点样器垂直接触到膜一端1.5cm处，待血清全部渗

5、入膜内，静置2～5min（点样线应细窄均匀集中）。3．电泳点好血清的薄膜条放置于电泳槽滤纸桥上，糙面（点样面）朝下，点样端在阴极端，膜条与滤纸紧贴、拉直，然后盖上槽盖，平衡5min后即可通电。电压为25V/cm，通电30～40min，关闭电源，电泳完毕。4．染色在电泳结束前10min配制染色应用液，取未用过的2.5cm×8cm醋纤膜一条，使其漂浮在染色液上直到膜条完全湿透。将电泳毕的膜条自电泳槽内取出，点样面朝上贴于载玻片上。然后取出浸泡在染色液中的薄膜小心覆盖于载玻片的电泳膜上，切勿拖动，操作需迅速，避免起泡和干燥。将载玻片移置于有盖搪瓷盘内，盘内放一块湿润的纱布，以保持盘内

6、湿度，置37℃恒温水浴箱中，保温40min（为节省时间可在40℃温度下保温5～10min），在有LDH活性的地方即可显出紫色区带。5．定量将染色后的膜条置于固定液中固定10min，待干后将各区带剪下溶于2ml洗脱液中，待膜溶解、色泽浸出以后用分光光度计在560nm波长处以洗脱液调“0”，求得各管吸光度。【计算】血清中，某种LDH同工酶占血清总LDH的百分比，按以下公式计算：【注意事项】1．红细胞内LDH活力比血清约高100倍，标本不能溶血。血清标本宜新鲜，室温下应在24h内做完。2．所用器材必须绝对清洁，整个试验过程必须控制温度和时间，以求结果准确。3．缓冲液pH要准确。4．电

7、泳时温度不宜过高。室温超过25℃时需用冰降温，以免影响酶的活力。5．最近有一些文献报导LDH同工酶H和M亚基均有突变种，导致电泳图谱有五种以上区带。6．也有文献报导人血中存在有抗H或抗M抗体，以至做同工酶分析时含H或M亚基的同工酶减少，甚至完全丧失。7．四氮唑蓝染色反应被用来测定同工酶活力，但有种非特异的酶被称为“无名脱氢酶（Nothingdehydrogenase,简称NDH）也可以产生类似反应，它干扰同工酶分析。在同工酶谱上NDH区带位置相当于LDH1和LDH3处。8．不同方法测定正常值