NYT544-2002猪流行性腹泻诊断技术.pdf

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1、ICS11.220B41中华人民共和国农业行业标准NY/T544-2002猪流行性腹泻诊断技术Diagnostictechniquesforporcineepidemicdiarrhoea2002一08一27发布2002一12一01实施中华人民共和国农业部发布355NY/'r544-2002前言猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院

2、哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、终有恩。NY/T544-2002猪流行性腹泻诊断技术1范围本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。2病毒分离与鉴定2.1材料准备2.1.1器材倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。2.1.2培养基及溶液的配制磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-经乙基呢嗓-N'-2一乙烷磺酸(HE

3、PES)液(配制方法见附录A),2.1.3细胞Vero细胞系。2.2病毒分离22-1病料采集采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。2.2.2病料处理将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000IU/mL青霉素,1000Wg/mL链霉素,PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22pm徽孔滤膜过滤，分装，一20℃保存备用2.2.3接种及观察将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Ver。细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37C吸附Ih，根据组织堵养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d-4d，按致细胞病变

4、作用(CPE)变化情况，可盲传2代一3代。2.3结果判定CPE变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞(7个~8个甚至几十个〕，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落，这是特征性的CPE，可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。3直接荧光抗体法3.1材料准备3.1.1器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。3.1.2荧光抗体(FA),3.1.3溶液配制:磷酸盐缓冲液(PBS),0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B)NY/

5、'r544-20023.2操作方法3.2.1标本片的制备3.2.1.1组织标本采急性期内(5d-7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片(4pm-7pm)，丙酮中固定10min，置PBS中浸泡10min-15min，风干或自然干燥。3.2.1.2细胞培养盖玻片将分离毒细胞培养24h-48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放人丙酮中固定10min，再置于PBS中浸泡10min-15min，风干。3.2.2FA染色3.2.2.1用0.02伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度(1:8以上合格)。12.2.24000r/min离心10min，取上清液滴于标本上。3.2.2.337'

6、C恒温恒湿染色30min，用PBS冲洗3次，依次为3min,4min,5min，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。3.2.3结果判定判定标准:在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。可根据细胞内荧光亮度强、弱分别作如下记录:a)++++:呈闪亮苹果绿色荧光;b)+++:呈明亮苹果绿色荧光;c)++:呈一般苹果绿色荧光;d)+:呈较弱绿色荧光;e)一:呈红色。结果为a)-d)者均判为阳性。4双抗体夹心ELISA4.1材料准备4.1.1器材:定量加液器、微量

7、移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。4.1.2猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶)。4.1.3溶液配制:洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液〔配制方法见附录C〕a4.1.4待检样品:发病仔猪粪便或肠内容物，用浓盐水1,5稀释，3000r/min离心20min，取上清液待检。4.2操作方法4.2.，冲洗包被板向各