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1、磷酸肌酸对大鼠心肌缺血再灌注后Bcl-2和Bax蛋白表达的影响中国实验诊断学2011年4月第l5卷第4期文章编号:1007—4287(2011)o4—0617～02磷酸肌酸对大鼠心肌缺血再灌注后Bc1.2和Bax蛋白表达的影响周丽防一,刘津,康治臣(1.吉林大学中日联谊医院心内科,吉林长春130033;2.长春市中心医院心内科;3,海洋石油总医院;4.吉林大学第二医院)细胞凋亡在多种疾病的发生,发展过程中有重要的意义.Bcl一2被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一,在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用,而Bax作
2、为Bc1.2的同源体,与Bcl一2一样在组织中广泛表达,作用是抑制Bcl一2表达及活性.有研究表明,Bax与Bcl.2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡.Bax过量时,形成Bax--Bax同二聚体,诱导细胞凋亡;Bcl一2过量时,形成Bcl一2Bax异二聚体,抑制细胞凋亡I;磷酸肌酸是一种极易被心肌细胞使用的能量形式E3j,磷酸肌酸基本药理作用为增加冠脉血流及血管灌注量,延长动物耐缺氧时间,保护缺血心肌等.本实验通过建立大鼠心肌缺血再灌注的模型,观察磷酸肌酸对体外大鼠心肌Bcl一2,Bax的改变,.以阐述其心
3、肌保护作用机制,为磷酸肌酸的临床应用提供实验依据.1材料与方法1.1实验动物及所用试剂健康成年雄性SD大鼠30只,体重200—250g,由吉林大学实验动物中心提供.磷酸肌酸由海口奇力制药股份有限公司生产,Bcl一2,Bax免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司.1.2实验动物和分组30只健康sD大鼠,体质量200～250g,随机分为正常对照组,缺血再灌注组,磷酸肌酸组,每组l0只,假手术组:仅麻痹后胸取左心室肌作为缺血前对照.缺血再灌注组:取心脏,建离体灌注模型;Krebs—Henseleit缓冲液预灌注15min
4、,待心脏稳定搏动后,给予常规含钾停搏液灌注,37.5~C停灌30rain,复灌60rain;磷酸肌酸组:收心脏,建立离体灌注模型,待心脏稳定搏动后,给予常规含钾停搏液加磷酸肌酸(3mg/kg)灌注,37.50C停灌30FdiI1,复灌60min.1.3动物模型制备将动物随机分为假手术组,模型组,磷酸治疗组,每组10只.用20%乌拉坦0.8g/充分麻醉大鼠后迅速置大鼠于动物台上并固定.剪开腹部皮肤,沿腹白线开腹,至剑突.提出肠道置于一侧,暴露下腔静脉,按3mg/kg经下腔静脉一617一注射肝素生理盐水.1min
5、后充分肝素化,剪开腹腔血管放血.迅速开胸,剪去胸腺组织,充分暴露心脏及大血管.游离主动脉至无名动脉远端,并剪断,迅速将其余大血管一并结扎并剪断,取出心脏,置于4~CK—H液中简单修剪.开启离体心脏灌注系统,灌注37%,95%O2,+5%CO2混合气持续氧合的K—H缓冲液,流量约15ml/min.器械提起主动脉,将灌注管道捅人,置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方,打结固定,开始灌注,心脏迅速恢复搏动.在肺动脉网锥处剪一小口,使冠状动脉流出液自然流出.剪开左心耳,将左心室测压管经切口,左心房,二尖瓣插入,并将另一连于
6、灌输瓶的灌注管插入左心房,打结固定.连接各测管道并调零,开始i贝0量.调整离体心脏灌注系统转速及流量,使主动脉根部压力约80CIIiH2O而灌注瓶与左心房落差约20emH'O,相当于左心室前负荷为20em}{2O,后负荷为80cmH2O脏持续稳定搏动.待心脏稳定搏动15min后,采用心脏停搏液从主动脉根部缓慢灌注(2min,压力7.98kPa)使心脏停搏,停搏后用冰盐水纱布包裹心脏,维持低温状态,停搏30min后复温,复灌37%,95%O2+5%C0,混合气持续氧合的K—H缓冲液,复跳,工作60min后停止实
7、验关闭灌注系统,取下心脏迅速液氮罐中冷却,然后放人3℃一7℃的冰箱中冷藏.心脏的人选标准是心脏灌流平衡30min后,符合心率>180次/min,冠状动脉流量5—10ml/min的心脏人选,缺血或再灌注期问若出现持续心室颤动>5rain的剔除.1.4IFUNEL法检测心肌细胞凋亡缺血区心肌4O0mg,放在40g/L中性甲醛中固定24h,逐级乙醇脱水,石蜡包埋切片按FUNEI试剂盒说明书进行标记染色,凋亡的细胞核被染成棕黄色,未凋亡的细胞核为深蓝色.高倍镜下每张切片随机选取1O个视野,计数凋亡阳性细胞
8、,以凋亡指数反映各组心肌凋亡的情况,凋亡指数=视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数×100%.一618—1.5免疫组织化学检测Bc1.2和Bax蛋白的表达应用与上述TUNEI法相同的组织蜡块切片行Bcl一2和Bax免疫组织化学检测.一抗:1:100磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的Bc1.2,Bax抗体.具体步骤按SABC试剂盒说明书操作,DAB显色,中性树脂封片.用PBS代替一抗作为阴对照.阳性表
