免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究论文

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1、免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究论文黄明罗卓荆肖伟张强【摘要】［目的］探讨利用免疫磁珠从SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量、高纯度雪旺细胞的方法。［方法］选用4～7dSD大鼠，无菌条件下取双侧坐骨神经，解剖镜下剥离去除神经外膜，获得神经束，将神经束剪碎至1mm3大小。采用双酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，离心并加入DF12培养液培养。7d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养，培养2d后进行传代接种。培养过程中对细胞进行形态学观察、计数及活力测定；MTT法绘制细胞生长曲线.freelethodtoobtainSchneassivelyandpu

2、relybyimmunomagicheadsmethod.［Method］SDratsthathadbeenbornicroscopethenervefasciclesandtheepineuriumpuritycell.Thenthenervetractallparticleabout1mm3.Tes(0.25%trypsinaseand0.2%collagenaseⅠ)ensttostoptheprocessofdigestion,centrifugate(1000r/min,5min)andDF12culturemediummunomagich

3、eads.DuringtheicroscopandvitalforceofSchmunofluorescenttestandrecordthepurity.［Result］ThecellseparatedfromtheSDrat'ssciaticnerveandculturedinincubatoredasSchmunomagicheadscanbeusedtopurifytheSchethodcanobtainmassivepurifiednormalschmunomagicheads;sciaticnerve雪旺细胞（Schaagiccellso

4、rting，德诺DYNA公司)，细胞磁性分离器（德诺DYNA公司）。MouseAntip75LNGFr（武汉博士德）。SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德）。MTT（Gibco）。DMSO(Gibco)。消化用酶0.25％的胰蛋白酶（Sigma）和0.2％的Ⅰ型胶原酶（Gibco）。仪器倒置相差显微镜（NIKON,TE2000E）,解剖镜，酶联免疫检测仪（蒙雷，芬兰）。1.2细胞分离脱颈法处死仔鼠，75％酒精浸泡消毒10min，Dhanks′液冲洗。切开股骨干后外侧皮肤，更换器械后，取双侧坐骨神经（长约1cm），置于已加入Dhanks′液的培养

5、皿中。16倍解剖镜下剥除神经外膜，分离得到神经束。Dhanks′液漂洗3次，每次0.5min。剪成1mm3左右的碎块，用吸管将其移至离心管中。加入0.25％的胰蛋白酶和1ml0.2％的Ⅰ型胶原酶,37℃混合消化约30～40min，吸弃上清液，再加入0.2％的Ⅰ型胶原酶4ml，37℃消化约50～60min，消化过程中每隔20min振荡消化液一次以利于消化。消化结束后，利用火焰抛光的玻璃吸管小心进行机械吹打，直至溶液呈混悬状，无明显肉眼可见组织。1000r/min离心5min，吸弃上清并加入DF12培养液4ml（含体积分数为20％胎牛血清）终止消化，再

6、次1000r/min离心5min，吸弃上清，加入DF12培养液4ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀，计数后将浓度为2×105/ml的细胞悬液接种于塑料细胞培养瓶，置体积分数为5％的CO2孵箱中37℃培养。培养过程中每24h观察细胞形态及生长情况。1.3细胞纯化细胞接种后第7～10d，吸弃培养液，加入0.25％的胰蛋白酶消化，制成细胞悬液4ml，而后加入MouseAntip75LNGFr100μl，37℃培养，10min后加入200μl免疫磁珠（标记羊抗鼠IgG），37℃培养15min后，置于磁性分离器上，吸去上清，加入DF12培养液5ml

7、(含体积分数为20％的胎牛血清)，5％CO237℃培养24h后,再置于磁性分离器上，分析上清。目的细胞在上清液中，移至培养瓶中继续培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养2d后即可进行传代。吸弃培养液，PBS液清洗1次，0.25％的胰蛋白酶室温（24℃）消化，约30s后可见细胞突起收缩，胞体变圆，立即加入DF12培养液4ml(含体积分数为20％的胎牛血清)终止消化。1000r/min离心5min，吸弃上清，加入DF12培养液4ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀，计数后按3～5×105/ml的细胞浓度传代。1.4细胞计数细胞生长过程中每2

8、4h显微镜下观察细胞的生长情况。在细胞接种及传代前均进行活细胞计数。计数方法：取待测细胞悬液0.1ml，加入