细胞因子受体嵌合抗体真核表达载体的论文

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1、细胞因子受体嵌合抗体真核表达载体的论文达载体。方法：用rtpcr方法从人胚肝组织中扩增epor胞外区基因及gp130跨膜区基因，并用限制性酶切连接方法拼接。用pcr方法从抗人afp单链抗体表达载体中扩增vl、vh基因，分别与人kappa轻链和人gammal重链恒定区基因重组，获得人鼠嵌合轻链和重链，再将eporgp130与嵌合重链连接，最后将嵌合轻链和heporgp130分别连接到质粒pvitro上，构建pvitroegig载体。结果：获得epor胞外区基因750bp，gp130跨

2、膜区基因900bp。重组真核表达载体经限制性酶切鉴定示epor、gp130基因、嵌合重链基因和嵌合轻链基因正确连接到载体pvitro。结论：成功构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体基因表达载体。【关键词】epor；gp130；嵌合抗体；克隆单克隆抗体技术自1975年问世以来，在生命科学研究及临床疾病检验、治疗等方面的应用日益广泛，然而单克隆抗体多来源于小鼠，使其在体内的应用受到一定限制，因此需对单克隆抗体进行人源化改造。欧美正式批准上市，以及正在临床试用的治疗性单抗中以人源化鼠单抗数量为多。在抗体

3、的制备过程中，抗体的表达载体系统多采用二氢叶酸还原酶（dhfr）基因作为可扩增选择标志基因，同时在培养基中加入甲氨蝶呤（mtx）来得到高拷贝量的抗体表达[1]。但是，mtx具有细胞毒性，会抑制细胞生长、引起细胞形态改变[2]。为了避免抗生素筛选药物对细胞的影响，各国学者做了大量研究。.日本学者m.kaediatedgeicallymodifiedcellamplification,amega），将抗体的vl、vh与epord2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，

4、通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞[3]。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株e.colidh5α由本室保存。pgemteasy载体购自美国promega公司。载体pag4622、pah4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pvitro2购自美国invivogen公司。抗人afp单链抗体表达载体pet32/scfv由本室构建。1.1.

5、2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。1.1.3主要试剂trizolreagent购自美国gibcobrl公司。onesteprnapcrkit（amv）、extaq、t4dnaligase及各种限制酶均购自大连takara公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1pcr引物的名称和序列　　1.2方法1.2.1epor胞外区基因及gp130跨膜区基因

6、的克隆和拼接trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总rna，用epf1/epr1引物对扩增epor胞外区基因，用gpf/gpr引物对扩增gp130跨膜区基因，rtpcr反应条件为50℃逆转录30min，94℃预变性5min，然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。胶回收纯化rtpcr反应产物epor1和gp130，并分别克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。用epf2/epr2引物对从epor1t载体上扩增epor胞外区基因，在其5′加入肠激

7、酶（enterokinase）的碱基序列：gacgacgacgacaag，胶回收纯化pcr反应产物epor2，并克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。用hindⅲ和claⅰ双酶切gp130t载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的epor2t载体连接，获得eeporgp130t载体。1.2.2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用vlf/vlr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vl基因，用clf/clr引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pag4622中扩增

8、cl基因[4]，分别克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。用bglⅱ和ecorⅰ双酶切vlt载体中的vl基因，和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrovl载体。用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切clt载体中的cl基因和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrol载体。1.2.3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用vhf1/vhr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vh1基因，克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。用ecorv和nheⅰ双酶